Megasphaera hexanoica 유래 Acyl-CoA Transferase를 이용한 유기산 고부가화 균주 개발

Abstract

화석연료의 과다한 사용으로 인해 발생하는 환경오염 및 자원고갈은 인류에게 큰 영향을 끼치게 되었으며, 이를 대체 할 수 있는 신재생에너지의 필요성이 대두되고 있다. 이 중 바이오매스를 이용한 미생물 기반 화학물질 생산 연구가 활발히 진행되고 있다. 이는 기존의 화석연료 화학물질을 대체할 수 있으며, 현재 존재하는 여러 공정을 그대로 사용할 수 있다는 점이 있으므로 신재생에너지 중 많은 주목을 받고 있다. 미생물을 기반으로 하는 유기산을 생산하기 위해 자연계에 존재하는 여러 미생물을 확인하던 중, 장내 미생물에 medium chain fatty acid 대량생산을 하는 우수한 종이 많음을 확인하였다. 이 종들은 내부에 존재하는 acetyl-CoA를 활용하여 carboxylic acid를 acyl-CoA로 전환하는 효소를 활용해 carbon elongation을 함을 확인하였다. 이 효소들은 terminal enzyme으로서 중요한 역할을 하는 것으로 보였으나 실제 역할은 밝혀진 것이 없었다. 본 연구에서는 이들의 역할을 규명하기 위해 여러 실험을 진행하였다. 이들을 Acyl-CoA transferase (이하 ACT) 로 칭하기로 하였고, Jeon et al. 에서 분리한 hexanoic acid 전환에 탁월한 Megasphaera hexanoica에서 ACT들을 분리하여 연구를 수행하였다. 본 연구에서는 상기 언급했던 ACT의 역할을 규명하기 위해 Clostridium acetobutylicum에서 유래한 alcohol dehydrogenase인 AdhE2, Escherichia coli MG1655를 활용하여 carboxylic acid를 alcohol로 전환하는 연구를 진행했다. AdhE2는 ACT가 전환한 acyl-CoA를 alcohol로 전환시켜 주는 기능을 하였고, 따라서 이를 활용하여 분석하기 쉬운 product인 alcohol을 전환하는 것을 통해 ACT의 역할을 규명하였다. 이를 위해 새로운 대사경로를 설계한 후 본 실험에 착수하였다. 먼저, ACT, AdhE2의 유전자 서열상 발현량을 각각 조절하여, 발현용 벡터인 pCDFDuet-1에 주입하여 최대의 성능을 끌어낼 수 있도록 유도하였다. 그리고 alcohol을 최대한 전환 할 수 있도록 대사경로가 조작된 Escherichia coli MG1655(△AdhE, △ldhA, △frdA, △pta)에 pCDFDuet-1을 넣어줌으로써 각 ACT를 사용하는 균주를 총 8개 개발하여, platform을 구축하였다. 여기에 추가로 적절한 alcohol dehydrogenase를 선정하여, alcohol 전환량을 높이기 위해 AdhE2 이외의 alcohol dehydrogenase 중 AdhE, PduP, AdhA를 선정 및 사용하여 alcohol 전환평가를 진행하였다. 본 실험을 통해, Escherichia coli MG1655의 유전자를 결실시키고 ACT, AdhE2의 유전자를 주입함으로써 alcohol의 전환에 최적화된 새로운 대사경로를 설계하였으며, 최종산물로 나오는 product인 alcohol 및 각종 대사산물을 비교하여 ACT가 각각 어떤 역할과 기능을 하는 지 확인하였다. 이를 통해 총 8개의 Megasphaera hexanoica유래의 ACT인 ACT_5510, ACT_3270, ACT_3280, ACT_23750, ACT_19420, ACT_7470, ACT_5060, ACT_24660을 확인하였다. 또한 여러 alcohol dehydrogenase들의 평가를 통해, 향후 현 platform의 개량 및 alcohol 전환에 많이 사용되는 AdhE, AdhE2, PduP-AdhA의 성능을 규명하였다. 72시간을 기준으로 각 ACT와 AdhE2가 삽입된 균주에 C3-C8 carboxylic acid를 1 g/L 씩 주입한 후 C3-C8 alcohol 전환성능을 확인 했을 때의 결과는 다음과 같으며, 이 중 전환 성능이 유사한 ACT들을 통합하고 평균을 구하여 제시하였다. 각 alcohol dehydrogenase의 변경에 따른 전환성능 차이에 대한 분석은 후에 서술할 예정이다. ACT_5510, 3270, 3280 균주의 경우 propanol은 0.93 g/L, butanol은 0.8 g/L, pentanol은 0.67 g/L, hexanol은 0.73 g/L, heptanol은 0.46 g/L, octanol은 0.24 g/L 를 생산했다. ACT_23750, 5060 균주의 경우 propanol은 0.59 g/L, butanol은 0.81 g/L, pentanol은 0.67 g/L, hexanol은 0.69 g/L, heptanol은 0.39 g/L, octanol은 0.23 g/L 를 생산했다. ACT_19420, 24660 균주의 경우 propanol은 0.6 g/L, butanol은 0.54 g/L, pentanol은 0.44 g/L, hexanol은 0.04 g/L 를 생산하였으며, heptanol, octanol은 생산하지 못했다. ACT_7470 균주의 경우 propanol은 0.45 g/L, butanol은 0.61 g/L, pentanol은 0.75 g/L, hexanol은 0.77 g/L, heptanol은 0.31 g/L, octanol은 0.31 g/L 를 생산했다. 실험을 통해 밝혀진 ACT들의 효소기능을 활용하면 기존의 바이오알콜 연구에 접목하여 product의 생산량을 향상시킬 수 있다. 나아가 다양한 바이오화학물질을 생산하는 연구에 ACT를 적용 할 수 있으며, 이 때 각 ACT의 선택적 생산능력을 활용하면 원하는 바이오화학물질을 필요에 따라 다양하게 확보 할 수 있다. 이 기능을 합성생물학 분야에서 활용하면 현재 제시한 연구들 이외에도 많은 도움이 될 것으로 기대되어 진다.