인공 지질단백질과 콜레스테롤 함량이 리포좀 이중막에 대한 단백질 결합에 미치는 영향

Abstract

분자적 수준에서 생체물질 간의 상호반응 결과를 확인하는 대표적인 방법으로는 효소면역분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)이 있다. 이와 다른 방법으로는 미세진동저울(quartz crystal microbalance, QCM), 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance, SPR)을 이용하는 방법이 있으며, 발색에 필요한 효소나 형광물질 등 표지(label) 물질을 사용하지 않는 장점을 갖고 있다. ELISA와 같이 QCM과 SPR도 센서표면에 샘플 중에 있는 특정 물질과 결합하는 ligand를 고정화하여 사용하여야 한다. 고정화 방법으로는 화학적 결합, 즉 공유결합이 주로 사용되고 있다. 공유결합은 안정적인 고정화를 만들 수 있는 장점이 있긴 하지만, 고정화를 위해 여러 단계를 거쳐야 하고, 고정화 물질을 제거하고 센서표면을 재사용할 수 없으며, 고정화의 방향성을 유도하기 어렵다는 단점이 있다. 본 연구에서는 QCM과 SPR 센서표면을 리포좀으로 처리하고 비공유 결합 방법으로 단백질을 고정화하는 조건을 찾고자 하였다. 이를 위해 silicon dioxide 표면을 리포좀 이중막으로 개질하는 조건을 조사하였다. 구형의 리포좀이 지질 이중층의 박막으로 변화하기 위해서는 친수성 표면과의 상호작용이 필요했다. 친수성 표면 위의 리포좀 이중막 형성은 QCM을 통해 확인하였다. 이렇게 생성된 리포좀 이중층에 단백질을 삽입시키기 위해 한쪽 끝에 oleyl group을 갖고 있고 다른 한쪽 끝에 NHS기가 PEG (polyethylene glycol)로 연결되어 있는 linker인 BAM (biocompatible anchor for cell membrane)을 이용하였다. 목적 단백질을 BAM에 결합시켜 인공적인 지질단백질(lipoprotein)을 만든 후 BAM의 oleyl group을 이용하여 리포좀 이중막층에 삽입시킬 수 있었다. 또 다른 센서표면의 하나로 L1 chip을 사용하였으며, 인지질(phospholipid) 및 콜레스테롤의 조성 성분이 다른 구형(vesicular) 리포좀을 제작하여 센서표면에 고정하였다. 리포좀이 고정된 표면은 생체막과 결합하는 막단백질로 알려진 factor VIII (FVIII)과 annexin V (AV)의 결합 양상을 관찰하는데 사용되었다. 리포좀은 phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), cholesterol (Chol)로 제작하였으며, 그 조성비율은 목적에 따라 달리하였다. SPR을 사용하여 결합 양상을 관찰하였다. PS는 AV와 FVIII의 결합에 있어 가장 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었으며 PS의 몰비율을 조정하여 AV의 결합량을 조정할 수 있었다. 또한 FVIII과 AV의 결합은 리포좀 이중막에 있는 콜레스테롤의 몰비율이 증가함에 따라서 증가하는 것을 관찰하였다. 이것은 콜레스테롤에 의해 리포좀이 함유하고 있는 PC와 PS의 배열이 재조정되어 나타난 결과로 사료되었다. PS가 없는 경우 콜레스테롤이 30%(w/w) 존재하는 PC:Chol 리포좀 이중막에는 막단백질이 거의 결합하지 않은 것으로 보아 PS가 없이 콜레스테롤 단독으로는 막단백질의 결합을 증가시키지 못하는 것으로 판단하였다. 그러나 PS가 있는 경우 단백질의 결합을 향상시키고, AV와 FVIII의 리포좀 이중막에 대한 결합 안정성을 향상시키는 것으로 관찰되었다. 특히 AV의 경우 해리상수 (dissociation rate constant, kd)가 10% 콜레스테롤을 함유한 리포좀 이중막에서 5배 안정화 되는 것을 보였다. 콜레스테롤이 없는 리포좀 이중막에서는 1.7 x 10-3 s-1의 해리상수로 나타났고, 콜레스테롤이 첨가된 후에는 3.3 x 10-4 s-1의 해리상수를 갖는 것으로 관찰되었다. 본 연구를 통해 solid supported membrane surface를 만들기 위해서 solid surface의 친수성, 온도 그리고 리포좀의 농도가 어떠한 조건에 있을 때 목적하는 지질 이중층이 형성될 수 있는지 확인할 수 있었다. 연구과정 중 지질 이중층을 만들 때 본 연구에서 제시된 조건을 따르면 간단히 지질 이중층을 만들 수 있다는 것을 확인하였다. 지질 이중층에 대한 단백질의 고정화는 BAM과 같이 지질 이중층 친화성을 가진 linker를 단백질에 결합시켜 인공지단백질을 만들면 비공유 결합으로도 지질 이중층에 고정화가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인공지질단백질을 만드는 과정이 단순하고, gold에 거의 흡착하지 않으면서 지질 이중층 표면에 특이적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 지질 이중층을 만들기 위한 조건이나, 인공지단백질이 지질 이중층에 결합하는 조건과 정도를 체계적이고 정량적으로 분석한 것은 지질 이중층 형성과 지단백질의 결합에 대한 특성을 구체적으로 확인하고, 재현성 있는 검출표면을 만들기 위해 도움이 될 수 있다는 점에서 의의가 있다고 사료된다. 비공유 결합을 유도하기 위한 또 다른 방법으로 PS를 함유한 리포좀과 FVIII, AV와 같은 막단백질을 사용해서 구현할 수 있었다. 막단백질 고정화는 리포좀 표면과 막단백질을 접촉시켜주는 단순한 과정으로도 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 센서표면에 대한 리포좀의 결합 및 제거를 반복적으로 수행할 수 있었서 동일 센서표면을 반복적으로 사용할 수 있었고, 이러한 장점은 분석에 소요되는 비용을 절감하는데 효과적일 것이라 사료되었다. AV와 FVIII의 고정화를 증가시킬 때, PS가 1차, 콜레스테롤이 2차 역할을 한다는 것을 추론해낼 수 있었다. 또한 콜레스테롤은 고정화량 증가에 관련될 뿐만 아니라 리포좀에 대한 단백질의 결합 안정성을 증가시킨다는 것을 정량적으로 확인할 수 있었다. 콜레스테롤과 PS를 이용하여 고정화를 증가시키고 결합 안정성을 높일 수 있다는 점을 증명해 가는 과정에서 특별하고 복잡한 화학적 처리과정을 전혀 사용하지 않았다는 것은 본 연구의 중요한 의미라 할 수 있다. 자연적으로 존재하는 콜레스테롤을 인지질과 몰비율을 조절하여 혼합하는 단순한 과정만으로도 누구나 간단히 특정 단백질의 고정화량을 증가시키고 안정화시킬 수 있으며, 고정화를 정량적으로 조절할 수 있다는 것은 본 연구에서 사용한 고정화 방법의 장점이라 할 수 있다.