화학 조성 배지에서 재조합 CHO-DG44 세포 배양 시 ammonium 생성 억제를 위한 배지 조성 전략

Abstract

재조합 항체의 생산에 일반적으로 사용되는 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주는 현탁 배양에 적합하고 높은 항체 생산성을 가져 높은 농도의 항체를 생산할 수 있는 host 세포주이다. 재조합 항체의 생산을 위해서 사용되는 회분식 배양은 조작이 쉬움에도 불구하고 세포 성장을 저해하는 부산물의 축적이 일어난다. 본 연구에서는 CHO-DG44 세포 배양 중 glutamine으로부터 생성되는 부산물인 ammonia의 영향을 최소화하는 방법에 대해 자체 제작한 화학 조성 배지에서 실험하였다. 세포 내 glutamine 대사에 의해 생기는 ammonia는 대부분 NH4+ 형태로 존재하는데 이는 세포 성장의 저해, 항체 생산 억제를 일으킨다. 이를 해결하기 위해 먼저 실험에 사용되는 재조합 세포주가 필요로 하는 glutamine 농도를 찾는 실험과 ammonium의 독성을 알아보기 위해서 배양 초기 ammonium을 첨가하여 배양하는 실험을 하였다. 또한 과량의 glutamine농도에서 배양하는 실험과 ammonium 생성을 억제하기 위한 방법으로 glutamine feeding실험과 glutamine의 대체물인 L-alanine-l-glutamine 대체 실험을 하였다. 초기에 ammonium 농도를 10, 20, 30mM로 조절한 독성 실험을 통해서 초기 농도가 20mM이상의 조건에서 세포 성장은 60%, 항체 생산은 40% 이상 저해되는 것을 알 수 있었다. Glutamine이 낮은 조건인 1, 2, 4, 8mM 농도에서 세포를 배양시켰을 때 1, 2mM조건은 세포 성장이 50% 이상 낮은 모습을 보였고 항체 생산에서는 1mM조건이 다른 조건에 비해 30% 낮게 나타났다. 초기 glutamine 농도 5, 10, 15, 20, 30mM로 조절하여 과량의 glutamine에 대한 세포 배양하였다. 초기 glutamine 5mM 조건이 다른 조건에 비해서 세포 배양 초반인 6일차 항체 생산량이 높고 생성되는 ammonium의 양을 줄일 수 있었으나 최종 12일차에 생성되는 항체의 양은 비슷하였다. 또한 glutamine의 대체물 실험을 통해서 L-alanine-l-glutamine은 glutamine과 비교했을 때 세포 성장, ammonium 과 항체 생산에 크게 영향을 미치지 않았으며 glutamine의 첨가 방법으로 glutamine을 초반에 15mM 넣는 방법보다 배양 초기 5mM과 3, 4일차에 5mM 씩 나누어 넣어주는 방법이 ammonium 생산을 줄일 수 있었지만 항체 생산면에서 크게 다른 모습을 나타나지 않았다. 위 실험들을 바탕으로 glutamine은 세포 배양에 필수적이고 세포주 1과 2에서 4mM이상일 때 더 낮은 농도의 조건보다 높은 세포 농도와 항체 생산량을 보였다. Ammonium은 10mM 이상일 때 두 세포주에서 세포 성장의 억제가 일어났고 20mM이상일 때 항체 생산이 크게 억제되었다. 이러한 ammonium을 줄이는 방법으로 glutamine 초기 농도를 4mM에서 5mM으로 고정하고 필요한 부분은 feeding을 통해서 생성되는 ammonium의 양이 20mM이 되지 않도록 첨가하여야 한다.