교종유래 간엽줄기세포에 의한 교종암 세포의 침윤성 획득 기전 연구

Abstract

신경교종 (glioma) 은 뇌에 발생하는 악성종양으로서, 4기에 해당하는 다형성 교모세포종 (glioblastoma multiform, GBM) 은 뇌종양 중에서도 가장 악성종양이다. 교모세포종은 수술만으로는 대부분 수 개월 이내에 재발하므로 수술 후의 방사선 요법과 화학적 요법 병행이 필수적이다. 그러나, 복합적인 치료에도 병행에도 불구하고, 환자의 생존율은 약 1.5년으로 매우 예후가 좋지 않다. 일반적으로 이 종양은 주변의 뇌로 퍼져가며, 정상적인 뇌와의 경계가 명확하지 않아 수술로 완전한 적출이 어려울 뿐만 아니라, 방사선 저항성을 가지고 있고, Brain blood barrier (BBB) 라는 특이한 혈관구조를 가지고 있어 항암약제의 전달이 어렵다. 신경교종은 악성화 과정에서 주변 뇌 조직으로의 침윤성을 획득하는데, 이러한 특성은 환자의 주요 사망요인으로 작용한다. 그러나 이러한 신경교종의 침윤성 획득과 관련된 명확한 기전이 규명되어지지 않아 신경교종 제어 기술 개발에 어려움을 겪고 있다. 암세포의 성장 및 악성화 과정은 종양미세환경을 이루고 있는 다양한 세포 및 종양 특이적 ECM component에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 암 조직은 암세포뿐만 아니라 섬유아세포 (fibroblasts), 면역 및 염증 매개 세포 (immune cells), 혈관내피세포 (endothelial cells) 등 다양한 세포들로 구성되어 있고 이들 세포들은 암세포와 끊임없이 상호교신을 하고 있는 것으로 알려지고 있는데, 이러한 암세포와 종양 미세환경 구성세포의 상호교신 작용은 암세포의 증식, 침윤/이동/전이성 조절 및 항암 치료에 대한 저항성 조절 등 암의 악성화 진행 과정에도 중요한 역할을 한다. 그러나 현재까지 알려진 대부분의 항암치료 저항성 및 암 악성화 제어 기술 연구는 암세포 자체의 증식 또는 이를 조절하는 세포신호전달 경로 변화만을 고려하여 진행되어, 종양 주변 환경의 변화에 의한 발암 및 악성화 과정을 이해하고, 근원적인 암세포의 항암치료에 있어서 한계가 있다. 이러한 관점에서 본 연구는 신경교종 세포의 이동성 및 침윤성 획득 과정에서 종양미세환경의 상호작용 및 조절 메커니즘을 밝히고자 하였다. 사전 연구에서 간엽줄기 세포 최소 요구조건인 1) 형태학: 부착하여 성장하는 방추형 세포, 2) 세포표면항원: CD105+CD73+, CD90+그리고 CD45-(단핵백혈구), CD31-(혈관내피세포), NG-(혈관주위세포), 3) 간엽세포 분화능력 (골 형성 세포, 지방 형성 세포, 연골형성 세포) 을 포함 하는 세가지를 만족함과 동시에 뇌에서 종양형성능력을 띄지 않는 교종 유래 간엽줄기세포 (tMSLCs) 를 분리하였다. 분리한 tMSLCs와 교종세포간의 상호작용을 알아보기 위해 3가지 배양 시스템을 이용하였다. Transwell을 간접적 공배양, 3D collagne-based 직접적 공배양, 3D collagen-based conditioned medium 처리 배양 후 교종세포의 표현형 (phenotype) 변화를 관찰하였다. 그 결과, tMSLCs와 공배양한 교종세포의 이동성 및 침윤성이 유의성 있게 증가하였고, mesenchymal transformation (MT) 표현형 유도인자인 zeb1, N-cadherin, β-catenin의 단백질 발현량이 증가되었다. 이러한 현상은 간엽줄기세포 (BM-MSCs)와 공배양 시에는 관찰되지 않았다. 교종세포의 이동성 및 침윤성을 증가시키고, MT 표현형 유도에 원인을 확인하기 위해 cytokine array를 실시하였다. tMSLCs와 교종세포를 공양했을 때, 증가되는 분비인자인 C5a, GROα, IL6, IL8 가 교종세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 영향을 관하였다. 그 결과, tMSLCs에서 C5a 생성을 siRNA, shRNA, neutralizing antibody를 이용하여 감소시켰을 때 교종세포의 이동성 및 침윤성이 현저히 감소하였다. 또한 tMSLCs에서 분비되는 C5a는 교종세포의 C5aR1 수용체와 결합하여 p38 MAPK 신호전달을 활성화 시키고, MT 표현형 유도인자인 zeb1, N-cadherin, β-catenin의 발현을 조절하였다. 이러한 결과들은 tMSLCs에서 분비되는 C5a 의존적으로 교종세포의 MT 표현형이 조절되어, 교종세포가 이동성 및 침윤성을 확득 할 수 있음을 의미한다. 또한, tMSLCs에서 분비되는 C5a는 autocrine으로 작용하여 ERK1/2 MAPK를 활성화 시키고, hyaluronic acid synthase 2 (HAS2) 의 발현을 증가시켰다. 증가된 HAS2는 교종세포의 침윤성을 조절한다고 알려진 extracellular matrix (ECM) 구성 성분인 hyaluronic acid (HA) 분비를 촉진하였다. tMSLCs 에서 분비된 HA는 교종세포의 RHAMM 수용체와 결합하여 교종세포의 이동성 및 침윤성을 유도하였다. 앞선 결과는 tMSLCs에서 분비되는 C5a가 ECM 분자의 발현을 조절함으로써, 교종세포가 침윤성을 획득할 수 있는 생화학적 ECM 리모델링을 할 수 있음을 시사한다. 암세포는 개별적인 세포이동 (individual movement) 또는 집단적인 세포이동(collective movement)을 할 수 있는데, 암 세포 주변에 존재하는 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts, CAFs)의 물리적인 세포외기질 재배열이 개별적인 세포이동 또는 집단적인 세포이동을 유도하는 주요원인임이 보고되었다. 흥미롭게도, tMSLCs는 CCL2/JAK1/MLC2 신호전달을 통해 actomyosin 수축을 유도함으로써 tMSLCs 주변의 ECM stiffness를 증가시킴을 관찰하였다. 종합적으로, tMSLCs는 교종세포의 미세환경을 구성하는 세포로써, 분비인자를 생성하여 교종세포의 침윤성 형질 획득을 유도할 수 있다. 또한, tMSLCs는 생화학적 ECM 리모델링을 함으로써 침윤 친화적 (pro-invasive) 종양미세환경을 공 할 수 있다. 뿐만 아니라, 물리적인 ECM 리모델링을 촉진하여 교종세포의 이동성 및 침윤성을 향상시킬 수 있다. 본 연구는 tMSLC가 교종세포의 악성화를 촉진시키는 종양 미세환경의 구성 세포임을 증명하였다.