Development of on-site DNA chip for subtyping and pathotyping of avian influenza virus

Abstract

전 세계적으로 조류인플루엔자 바이러스가 지속적으로 발생하고 있으며 조류인플루엔자 바이러스의 유행에 따른 피해가 막대하다. 특히 우리나라에서는 주로 북방에서 철새가 국내로 들어오는 겨울철에 발생이 시작된다. 조류인플루엔자는 거의 매년 같은 패턴으로 발생하고 있으나 실질적으로 이를 막기 위한 대책은 대량 및 예방적 살처분이 유일하다. 조류인플루엔자 바이러스는 이론적으로 총 144종의 아형이 존재하고, 조류에는 이 모든 아형이 감염될 수 있지만, 조류의 종속에 따라 감수성과 질병 발현여부는 각기 다르다. 또한 바이러스의 병원성 정도에 따라 고병원성과 저병원성 바이러스로 구분된다. 저병원성 바이러스의 경우 호흡기나 소화기에 증식하여 무증상이거나 경증을 일으키지만 고병원성 바이러스는 높은 폐사율과 심각한 산란율 저하를 유발하여 경제적, 국가적인 피해가 심각하며 최근에는 인체감염 사례까지 발생하여 큰 위협이 되고있다. 그러나, 혈청 아형이 매우 다양하고 변이가 쉽게 일어나기 때문에 백신에 의한 예방 등이 어려운 실정이며 현재의 진단법으로는 확진까지 약 일주일 정도 소요된다. 본 연구에서는 현장에서 조류인플루엔자 바이러스의 검출 및 주요 혈청형(H5,H7,H9)과 병원성을 판별하여 해당 질병의 전파를 차단하고 신속한 대처를 통해 피해를 최소화 하기 위한 현장형 진단 기술의 개발을 목표로 하였다. 인플루엔자 A 바이러스를 검출하기 위해서, 매우 보존적인 매트릭스 유전자에서 모든 인플루엔자 A 바이러스에 공통적으로 존재하면서 변이가 없는 부분을 표적화 하도록 하여 특이적인 프라이머 쌍과 탐침을 제작하였다. 또한 주요 혈청형의 판별을 위하여, 헤마글루티닌 유전자에서 각 혈청형 별로 특이적이며 해당 혈청형 내에서는 보존적인 서열부분을 표적화 하도록 하여 각 형청형 별 특이적인 프라이머 쌍과 탐침을 제작하였다. 병원성 판별을 위해서는 헤마글루티닌 유전자 내에서 병원성 발현 여부에 연관성이 뚜렷한 HA Cleavage site를 표적화하여 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 프라이머쌍과 탐침을 제작하였다. 본 연구에 있어 민감성과 특이성을 향상시키기 위하여 모든 탐침에는 이중 소광제를 부착하여 사용하였고, 다중 프라이머 쌍과 다중 탐침, 잠긴 핵산을 사용한 탐침을 사용하기도 하였다. 상기 조류인플루엔자 바이러스 검출 및 주요 혈청형과 병원성 판별을 위해 제작한 각 프라이머 쌍과 탐침을 이용하여, 현장형 유전자 칩 기반 역전사 중합효소 연쇄반응 장비에 적용하였을 때 반응 시간 37분 33초 안에 검출 및 판별이 가능한 것을 확인하였다. 본 장비에서 제공하는 분석 프로그램에서의 칩 화면을 통해 반응 전과 반응 후의 발색비교를 이용하면 해당 분야에 전문성이 없는 비전문가도 쉽게 판별 결과를 확인하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 또한 해당 분석법은 1회 수행 당 검사 비용이 비교적 저렴하고 실험 방법이 간단하다. 따라서 본 연구에서 고안된 조류인플루엔자 바이러스 검출 및 주요 혈청형, 병원성 판별용 프라이머 쌍과 탐침을 이용하여 본 연구에서 표지하는 포터블 장비에서 단일 유전자칩을 구성한다면, 현장에서 신속하게 조류인플루엔자 바이러스의 검출 및 판별이 가능하여 빠른 진단을 통한 조기 대응으로 차단 방역 및 최소한의 살처분을 통해 경제적, 국가적 피해의 최소화를 기대할 수 있을 것이다.; Avian influenza virus outbreaks continuously occur worldwide, often with devastating effects. In Korea, particularly, this virus has a peak during winter, when migratory birds enter the country, mainly from the north. Although avian influenza viral infections occur almost every year in the same pattern, the only measure to prevent them is preventive and massive slaughter. Theoretically, there are 144 subtypes of AIV. All AIV subtypes are infectious, but their susceptibility and manifestations vary according to the bird species. In addition, AIV can be divided by degree of pathogenecity into highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIV) and low pathogenic avian influenza viruses (LPAIV). LPAIV is asymptomatic or mildly symptomatic and can be found in the respiratory or digestive system. In contrast, HPAIV can cause high avian mortality, and decreases spawning rate, thus leading to serious damage to the national economy and even to human health. Moreover, AIV is very difficult to prevent by vaccination because of its various subtypes and frequent mutation occurrence. Currently. it requires approximately a week to obtain an accurate diagnosis. In this study, I aimed to develop an on-site diagnostic technique to detect the avian influenza virus and identify its major subtypes (H5, H7, H9) and pathotypes in the field, to prevent the spread of disease and to minimize damage through prompt response. To detect influenza A viruses, primer pairs and probes were designed by targeting mutation-free regions shared by all influenza A viruses in the highly conserved matrix (M) gene. To identify the major subtypes, specific primer pairs and probes were designed for each subtype by targeting conserved sequences within the same subtype and the specific sequences of hemagglutinin (HA) genes in each subtype. For pathotyping, specific primer pairs and probes for HPAIV were designed by targeting specific sequences of the HA cleavage site, that are highly related to the pathogenicity of AIV in the HA gene. In order to improve the sensitivity and specificity, all probes used in this study were equipped with a double quencher. Multiple primer pairs and locked nucleic acid (LNA) probes were also used. By using primer pairs and probes designed for the detection, subtyping, and pathotyping of AIV, AIV detection and discrimination were confirmed to be possible within 37 minutes 33 seconds of reaction time, using the chip-based reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) portable equipment. Colorimetric analysis was performed to detect the color before and after the reaction, using a chip screen provided with the analytical program in this equipment.[3] This method enables easy interpretation of the results by a non-experts in the field. In addition, the test method is relatively inexpensive and simple to use. Therefore, the single gene chip constructed by using primer pairs and probes designed for AIV detection, subtyping, and pathotyping, will permit rapid detection and identification of AIV in the field. Such biosecurity (prevention of disease) would minimize economic and national damage and reduce the number of animals slaughtered owing to early response resulting from rapid diagnosis.