Comprehensive comparison between CRISPR-Cas9 and -Cpf1 in human cell lines

Abstract

CRISPR-Cas는 박테리아의 내재적인 면역 체계로 많은 박테리아 종에서 발견되었으며, 그 중 두 개의 RNA 유도 엔도뉴클라아제인 Cas9와 Cpf1이 강력한 게놈 편집 도구로 널리 사용되고 있다. 그러나 이 두 CRISPR 시스템에는 약간의 차이가 있다. DNA 절단을 위해서 Cas9는 NHN과 RuvC 도메인을 가지고 있지만, Cpf1은 RuvC 도메인 하나만을 가지고 있다. 또한 Cas9의 PAM (protospacer adjacent motif) 서열은 NGG이지만 Cpf1은 TTTV (V = A, G, C 서열)이다. 따라서 우리는 인간 세포에서 직접 비교하기 위해 두 CRISPR 시스템이 타겟 하는 내생의 게놈 영역을 선택했으며, 두 CRISPR 시스템의 절단 영역 일치 시켜서 보다 명확히 비교하였다. 우리는 68개의 내생의 타겟에서 성공률 (>1%)과 평균 돌연변이 비율을 비교하였다. 또한 우리는 34개 타겟에서 Cas9과 Cpf1의 각각 수리 패턴이 다름을 확인하였다. 그리고 우리는 SpCas9, AsCpf1, 그리고 LbCpf1의 K.I 효율 (ssODN, HDR, and NHEJ-mediated K.I)을 몇몇의 내생의 타겟에서 측정하였다. 이 포괄적인 비교는 어떤 CRISPR가 게놈 공학 도구로서 가장 효과적인지를 알려 줄 것이다. 또한 CRISPR-Cpf1이 아닌 CRISPR-Cas9을 사용하여 유전자의 기능을 알기 위해 다양한 knock-out 세포주를 확립하였다. 총 타겟 유전자는 6개로 DNA 수리와 면역 반응에 관련된 유전자이다. 본 연구에서 유전자 네트워크의 생리학적 기능을 알아보기 위해 하나의 유전자 뿐만 아니라 두개, 세개의 유전자가 망가진 knock-out 세포주를 확립하였다. 이 연구를 통해서, CRISPR-Cas9 기술이 유전자의 기능과 다른 유전자와의 연관성을 밝히는데 유용하다는 것을 확인하였다.