Identification of atherosclerotic lipid-laden macrophage heterogeneity using single-cell transcriptome analysis

Abstract

Macrophages are immune cells involved in various metabolic diseases such as obesity, atherosclerosis, and non-alcoholic fatty disease. Although the previous findings classified the macrophages as ‘M1-like’ pro-inflammatory and ‘M2-like’ anti-inflammatory macrophages, recent brand-new cell analyses such as l next-generation sequencing revealed that it is necessary to reconsider this classification. Using a mouse model, I assessed cell analysis of cell distribution and the role of lipidladen macrophages in atherosclerosis. I developed a lipid probe-based cell analysis method for detecting foamy macrophages and performed single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to classify aortic macrophages. First, I used the fluorescent lipid probe 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (BODIPY493/503) and assessed side-scattered light (SSC) as an indicator of cellular granularity to detect foam cell. The foam cell is SSChiBODIPYhi, expressing CD11c in intimal atheroma. Accumulation of foamy macrophages positively correlated with the severity of atherosclerosis. Second, I performed scRNA-seq of aortic immune cells and bulk RNA-seq of SSCloBODIPYlo and SSChiBODIPYhi aortic intimal macrophages. The foamy macrophages expressed fewer inflammatory genes but more lipid-processing genes than non-foamy macrophages. The non-foamy macrophage population represented IL (interleukin)-1β and other inflammatory genes in mouse and human atherosclerotic aorta. Third, I identified that the foam cells were heterogeneous in transcript levels using foam cell scRNA-seq: Macrophage-, smooth muscle cell-, and some endothelial cell-derived foam cells. The foamy macrophages differed from other aortic macrophages when comparing the enriched gene expressions to other macrophages. Some macrophage-derived foam cells are proliferative. Furthermore, the foamy macrophages are comparable to lipidassociated macrophages of obese visceral adipose tissue. Collectively, these results indicate that 1) BODIPY staining and cell granularity analysis method successfully separate aortic foam cells. 2) the foamy macrophages show less inflammatory profiles such as Il-1β and enriched gene expression in cholesterol and lipid metabolism. 3) Accordingly, my research suggests foamy macrophages are metabolically activated cells in atherosclerosis. It will provide clues to study macrophage characteristics and develop cell-based therapy for atherosclerosis. |대식세포는 비만, 동맥경화, 비 알콜성 지방간염과 같은 다양한 대사질환에 관여하는 면역세포이다. 기존의 연구들에 따르면 이러한 대식세포를 ‘M1 유 사’ 전염증성 대식세포와 ‘M2 유사’ 항염증성 대식세포로 분류했지만, 최 근 기존의 분류를 재고할 필요가 있다는 사실이 밝혀지고 있다. 나는 마우스 실험 모델을 이용하여 동맥경화 혈관 내 지질함유 대식세포인 포말세포(foam cell)의 분포와 역할 분석을 실시하였다. 먼저 나는 형광지질 탐색인자인 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl- 4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (BODIPY493/503)과 세포 과립성 측정 지표인 측면산란광(side scatter, SSC)을 이용하여 포말세포를 분석하고자 하 였다. 이 방법을 통해 포말세포는 SSChiBODIPYhi이며, 이들이 혈관 내막에 상주하며 CD11c를 발현함을 확인하였다. 두번째로 나는 대동맥 면역세포의 단일세포 RNA 서열 분석법과, 혈관 내막의 SSCloBODIPYlo 비 포말성 대식 세포 및 SSChiBODIPYhi 포말성 대식세포의 RNA 서열분석을 실시하였다. 포 말성 대식세포는 염증 유전자를 거의 나타내지 않았지만, 많은 지질처리 관련 유전자를 발현함을 확인하였다. 반면 혈관 내막 비포말성 대식세포는 동맥경 화 대동맥에서 인터류킨 1 베타 (IL-1β)와 다른 많은 염증성 전사인자를 발현함을 확인하였다. 세번째로 SSChiBODIPYhi 포말세포의 단일세포 RNA 분석을 통해, 나는 포말세포집단이 전사분석 수준에서 이질성이 있음을 확인 하였다. 그리고 포말성 대식세포는 다른 대동맥 대식세포와 구별되며 또한 비 만 내장 지방조직에서 확인된 지질 관련 대식세포와 유사한 대사적 활성화 상 태에 있음을 확인하였다. 종합적으로 1) BODIPY 염색과 세포의 과립도 분석을 이용하여 성공적으로 대동맥 포말세포의 정량분석과 분리가 가능하였다. 2) 포말성 대식세포는 Il- 1β 와 같은 염증성 유전자 발현이 낮고, 콜레스테롤 및 지질대사에 관련한 풍부한 유전자 발현을 보여준다. 3) 따라서 나의 연구는 포말성 대식세포가 동맥경화증에서 대사적으로 활성화된 세포임을 시사한다. 그리고 이는 동맥경 화 내 대식세포 특성을 연구하고 세포 기반 치료법을 개발 할 수 있는 실마리 를 제공할 것이다. 중요 단어: 대식세포, 포말세포, 단일세포 RNA 서열분석, IL-1β, 콜레스테롤