Development of Light-sensitive Oxygen Generating Biomaterials through Alginate-Chloroplast transit peptide conjugation

Abstract

Tissue engineering is the field of developing new tissue structures to repair, improve, or replace damaged tissues or organs. Despite the remarkable progress, hypoxia occurs due to the inability to generate blood vessels in the early stages of transplantation. Insufficient oxygen leads to decrease of transplanted cell viability and efficacy of the engineered tissue. Until now, oxygen-generating biomaterials have been developed that can supply sufficient oxygen to transplanted cells. However, there are still limitations in that limited oxygen supply time and inability to control carbon dioxide. To solve this problem, I devised a study that can use the chloroplast, an organelle that can control oxygen and carbon dioxide. Chloroplast-Transit-Peptide (CTP), which can be inserted into the outer membrane of chloroplasts, was used to improve stability and local effect when the chloroplast was fixed. In addition, alginate, a biocompatible polymer capable of cross-linking with calcium chloride solution, was used to form a hydrogel. The Light-sensitive Oxygen-Generating biomaterial to extend the oxygen supply time and increase the cell viability after transplantation can generate oxygen from photosynthesis and consume carbon dioxide produced by cellular respiration through calvin cycle. In addition, the production rate of oxygen can be accelerated upon exposure to 660 nm, a specific wavelength range of Near-infrared (NIR). Alginate-CTP conjugate (Al-CTP) was synthesized by carbodiimide coupling reaction using EDC / NHS. The synthesis of AlCTP was verified by using NMR spectroscopy and FTIR. Afterwards, the actual binding ratio of the compound, the stiffness of Al-CTP gel, and the chloroplast encapsulation ratio were verified to optimize the synthesis ratio. After mixing with the chloroplast, TEM and Confocal image evaluated that the CTP can anchored to the outer membrane of the chloroplast. To determine whether this biomaterial produce oxygen, the amount of oxygen concentration was confirmed according to the presence or absence of light conditions in a specific wavelength (660 nm) under normoxic and hypoxic (1 % oxygen concentration) conditions. As a result, it showed a higher oxygen production rate than control at the chloroplast concentration of 104 and 106 chloroplasts/ml. In addition, the amount of oxygen generated in the presence of CTP increased more effectively. Finally, in vitro tests were conducted to evaluate that the ability of oxygenation and cell viability and functionality in scaffold. This scaffold produced more oxygen than control and encapsulated Islets were survive and secrete insulin well. In conclusion, Light-sensitive Oxygen-Generating Biomaterial using chloroplasts have structural stability and can generate oxygen above a control level under hypoxic and normoxic conditions. So, it is an effective way to maintain cell viability and functionality during transplantation. Therefore, this biomaterials have a high potential to be widely used in tissue engineering fields such as cell therapy and organ transplantation in the future.| 조직 공학은 손상된 조직이나 장기를 복구, 개선 또는 대체하기 위한 새로운 조직구조를 개발하는 분야이다. 조직공학 분야의 눈부신 진보에도 불구하고, 이식 시 초기 단계에서는 혈관이 생성되지 않아 저산소증이 발생하게 되며, 이로 인해 이식된 세포가 충분한 산소를 공급받지 못해 세포의 생존율 및 이식체의 효능의 감소를 초래한다. 현재까지 세포를 봉입하여 이식체에 충분한 산소를 공급해주기 위한 산소생성 소재들이 개발되어져 왔지만, 제한된 산소 공급 시간과 이산화탄소 조절이 불가능하다는 한계점이 여전히 존재한다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 연구에서는 산소와 이산화탄소를 제어할 수 있는 세포 소기관인 엽록체를 이용할 수 있는 연구를 고안하였다. 엽록체를 조직공학 소재로 사용하기 위해서는 엽록체를 고정시켜야 안정성과 국소적인 효과가 좋아지고, 따라서 엽록체의 외막에 삽입될 수 있는 Chloroplast-Transit-Peptide (CTP)을 이용하였다. 또한, 하이드로겔로 제작하기 위해 칼슘용액과 가교반응이 가능한 생체적합성 고분자인 알지네이트를 이용하였다. 산소 공급 시간을 연장하고, 이식 후 치료세포의 생존율을 높이기 위한 빛 민감성 산소 생성소재는 광합성 과정으로부터 산소를 생성할 수 있으며, 세포호흡을 통해 생산된 이산화탄소를 암반응을 통해 소비할 수 있다. 또한, 산소의 생산속도는 근적외선의 특정 파장대인 660 nm를 노출시에 가속화할 수 있다. Alginate-CTP 합성물은 EDC/NHS를 이용한 carbodiimide coupling reaction으로 합성하였다. Al-CTP의 합성은 NMR과 FTIR을 동해 검증하였다. 이후, 합성물의 실제 결합 비율과 젤의 강도, 엽록체 봉입률을 검증하여 합성 비율을 최적화하였고, 엽록체와 혼합 후 TEM과 Confocal을 통해 CTP가 엽록체의 외막에 접합되는지 확인하였다. 제작한 산소생성물질이 실제로 산소를 방출하는지 알아보기 위해 정상산소 상태와 1%의 저 산소 조건에서 특정 파장(660 nm)의 빛 조건 유무에 따른 산소 방출량을 확인한 결과, 104및 106 mg/ml의 엽록체 농도에서 최대 8% 이상의 높은 산소 방출량을 보였다. 또한, CTP의 존재 하에서 산소 발생량이 더욱 효과적으로 증가하였다. 마지막으로, in vitro 실험을 진행하여 Islet을 봉입한 산소생성물질의 독성 테스트, 산소 발생량 측정, insulin 분비 능력을 통해 산소 공급 능력과 물질 안에서 세포의 생존 및 기능이 잘 유지됨을 확인하였다. 추가 연구로, 장기간의 in vivo 실험을 통해 산소 발생의 지속성을 확인하고, 이산화탄소와 활성산소종 제어 능력을 검증할 계획이다. 또한 bead 및 3D 구조물 형태로 제형의 최적화를 통해 더 개선된 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다. 결론적으로, 엽록체를 이용한 빛 민감성 산소 생성소재는 구조안정성을 지니고 저 산소 상태와 정상산소 상태에서 모두 일정 수준 이상 산소를 생성할 수 있는 생체소재로, 이식 시 세포의 생존율과 기능을 유지할 수 있는 효과적인 방법이다. 따라서, 본 소재는 앞으로 세포치료 및 장기 이식 분야 등 조직공학 분야에 광범위한 활용 가능성이 높을 것으로 기대된다.