Stimuli Triggered Self-assembly of Elastin-based Block Copolypeptides for Advanced Drug Delivery Systems and Tissue Engineering

Abstract

The fabrication of protein based stimuli-responsive and multifunctional nanomaterials that self-assemble into defined structures offer tremendous potential for biomedical applications, as their designs are tailorable at molecular levels for desire characteristics. Therefore, Elastin-based polypeptides (EBPs) have been extensively studied for their lower critical solution temperature (LCST) behavior, their biocompatibility and most importantly their easy purification method. Furthermore, EBP-based block copolymers self-assemble into diverse nanostructures such as spherical micelles, vesicles and smart hydrogels owing to their programmable design with multifunctional domains. In this dissertation, we designed and syhthesized the block copolypeptides of EBP with novel proteins that self-assembled into different structures such as micelles, vesicles and hydrogels. EBP-based block copolypeptides were seamlessly cloned via recursive directional ligation (RDL), over-expressed in E.coli and non-chromatographically purified by inverse transition cycling (ITC). Firstly, we reported the self-assembly of EBPs with resilin-based polypeptides (RBPs) that exhibite the upper critical solution temperature (UCST) behavior. The fusion of EBP with LCST and RBP having UCST resulted into converse phase transition behavior of diblock copolypeptides that self-assembled into switchable nanostructures depending on their thermal responsiveness. Next, we study the block length effect of each block on self-assembly of nanostructures and different nanostructures such as micelles and vesicles were observed with varying the block length of EBP and RBP. Furthermore, we developed the injectable hydrogel of EBP-RBP based triblock copolypeptides that was capable of both physical cross-linking due to thermall responsiveness of terminal EBPs and photochemical cross-linking of middle RBP blocks. Next, we designed the block copolypeptides of EBPs with coiled-coil forming peptides (CCP) in different block length ratio that self-assembled into hydrogels under physiological conditions. Depending on their block length ratio, we observed sol-gel and gel-gel transition of EBP-CCP triblock copolypeptides due to intra- or intermolecular interaction of CCPs and thermal responsiveness of EBPs. Finally, we modified the EBPs for adhesive properties and fused with β-sheet forming suckerin. EBP-suckerin di- and triblock copolypeptides self-assembled into vesicles and hydrogel respectively due to β-sheets of suckerin and cross-linking of EBPs. Consequently, different structures were prepared using thermal-responsivenss of EBPs and self-assembly of novel proteins that could be potential candidates for advenaced drug delivery systems and tissue engineering.|정의된 구조로 자가조립이 되는 단백질 기반의 자극-응답 및 다기능 나노 물질의 제조는 분자 수준에서의 디자인을 통해 원하는 특성을 적용할 수 있다는 특성으로 인 해 생의학 응용분야에 엄청난 잠재력을 제공한다. 그러한 이유로, 엘라스틴에 기초한 폴리펩타이드 (EBP)는 그들의 하안임계용액온도 (LCST) 거동, 생체 적합성 및 용이한 정제 방법에 대해 광범위하게 연구가 진행되어왔다. 더욱이, EBP의 블록 공중합체는 다기능적인 도메인을 가지는 설계에 따라서 구형 미셀, 소포, 하이드로겔과 같은 다양 한 나노 구조체로의 자가조립이 가능하다. 본 학위 논문에서, 우리는 미셀, 소포 및 하이드로겔과 같은 다른 구조로 자기 조 립되는 EBP와 새로운 단백질들의 블록 코폴리펩타이드를 디자인하고 합성하였다. EBP 블록 코폴리펩타이드는 반복되는 지향적 라이게이션 (RDL)을 통해 이음매 없이 클로 닝 되었으며, 대장균 내에서 과발현된 후 크로마토그래피가 아닌 역상전이 사이클링 (ITC)에 의해 정제되었다. 먼저, 우리는 상한임계용액온도 (UCST) 거동을 나타내는 레 질린에 기초한 폴리펩타이드들 (RBPs)을 가진 EBP들의 자가조립을 보고하였다. LCST 를 가진 EBP와 UCST 를 가진 RBP의 융합은 그들의 열적 반응성에 따라서 전환이 가능한 나노구조체로 자가 조립하는 이중블록 코폴리텝타이드의 역상 전이 거동을 나 타내었다. 다음으로, 우리는 나노구조체들의 자가조립에 대한 각 블록의 블록 길이 효 과를 연구하였고, EBP와 RBP의 다양한 블록 길이 변화와 함께 미셀들 및 소포들과 같은 다른 나노구조체가 관찰되었다. 또한, 우리는 양 말단의 EBP들의 열적 반응성을 통한 물리적 가교와 중앙의 RBP들을 통한 광화학 가교를 할 수 있는 EBP-RBP 삼중 블록 폴리펩타이드의 주사형 하이드로겔을 개발했다. 다음으로, 생리학적 조건 하에서 하이드로겔로 자가조립되는 다른 블록 길이 비율의 코일드-코일 형성 펩타이드들 (CCPs)를 갖는 EBP들의 블록 코폴리펩타이드들을 설계하였다. 그들의 블록 길이 비율 에 따라, CCP의 분자 내 또는 분자간 상호 작용과 EBP의 열적반응성으로 인한 EBPCCP 삼중 블록 코폴리펩타이드의 졸-겔 또는 겔-겔 전이를 관측하였다. 마지막으로, 접착성을 위해 EBP들을 수정하고 베타시트 형성 suckerin과 융합시켰다. EBP-suckerin 이중 혹은 삼중블록 코폴리펩타이드는 suckerin의 베타시트 및 EBP들의 가교로 인해 각각 소포 및 하이드로겔로 자가 조립되었다. 결과적으로, EBP들의 열적반응성과 새로 운 단백질들의 자가조립을 통해 새로운 약물 전달시스템과 조직공학에 대한 잠재성을 갖는 다른 구조들이 준비되었다