NO 합성과 알레르겐 관련 사이토카인 발현에서의 PLD의 역할규명

Abstract

Phospholipase D (PLD)는 인지질 가수분해 효소의 하나로 세포막의 주요 구성성분인 phosphatidylcholine을 가수분해하여 세포 내 신호전달의 주요 이차 전령자인 phosphatidic acid (PA)를 생산하는 주요 신호전달 단백질이다. 본 연구에서는 대식세포 내에서 LPS 의 자극에 의한 NO 합성에서 PLD2의 역할을 규명하고자 하였다. 대식세포에 LPS를 처리하면, NO 합성과 iNOS와 COX-2의 발현이 증가와 더불어 PLD1, 2의 발현도 증가됨을 확인하였다. 그리고 PLD의 활성을 억제하는 1-butanol을 처리한 결과 NO합성과 iNOS와 COX-2의 발현이 억제됨을 확인하였다. NO합성에 PLD가 어떻게 관여하고 있는지 알아보기 위해 PLD1,2와 이들의 Dominant negative form을 대식세포에 transfection 시켰다. 그 결과 PLD2는 LPS를 처리하지 않아도 NO합성과 iNOS와 COX-2의 발현을 증가시킨다는 사실을 밝혀냈다. 반면, DN-PLD2는 NO 합성물질인 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 이와 같은 결과는 PLD2 발현은 대식세포에서 NO합성에 중요하다는 것을 암시한다. LPS는 다양한 신호분자에 영향을 주지만 우리는 그 중에서도 mTOR 관련 신호전달과 NO의 합성의 관련성을 알아보기 위해 mTOR의 억제인자인 rapamycin을 처리하였다. 그 결과 rapamycin에 의해 NO의 합성과 iNOS와 COX-2의 발현이 억제됨을 확인하였고 LPS에 의해 인산화되는 ERK1/2 MAPK와 mTOR의 하부 신호인자인 p70S6kinase도 억제됨을 알아내었다. 그리고 PLD의 활성을 억제하는 0.5 %의 1-butanol을 처리한 결과 NO 합성물질인 iNOS와 COX-2의 발현이 억제되고 이와 관련된 mTOR 관련 신호전달과정이 억제됨을 밝혀냈다. 이와 같은 결과를 더욱 정확히 규명하기 위해 PLD2의 활성을 억제하는 mPLD2 siRNA 를 대식세포에 transfection 한 결과 NO 합성과 iNOS와 COX-2의 발현 뿐만 아니라 LPS에 유도되는 mTOR 관련 신호전달과정이 억제됨을 확인하였다. 본 연구에서 얻어진 실험결과를 통해 PLD2 는 LPS에 의해 유도된 대식세포내에서의 NO 합성에서 중요하게 작용한다고 생각되어 지며, NO 합성 과정 동안 mTOR 신호전달과정과 MAPK의 인산화를 경유하여 조절됨을 최초로 규명하였다. 이 결과는 PLD2 발현의 증가와 함께 LPS에 의해 유도된 NO 합성 과정에 있어 앞으로의 연구에 있어 기초가 되는 중요한 자료가 될 것이라고 사료된다.; The purpose of this study was to identify the role of phospholipase D2 (PLD2) in lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) synthesis. LPS enhanced NO synthesis and inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase 2 (COX-2) expressions in macrophage cell line, Raw 264.7 cells. We found that the expressions of PLDs were increased when we stimulated Raw 264.7 cells with LPS. By blocking of PLD activity using 1-butanol, NO synthesis and expressions of iNOS and COX-2 were decreased. To confirm the role of PLD in NO synthesis in macrophages, we constructed stable cell lines that transfected by PLD1 and PLD2, and their dominant negative forms. Interestingly, we found that only PLD2 overexpression, not PLD1, increased NO synthesis and expressions of iNOS and COX-2. Overexpression of dominant negative form of PLD2 (DN-PLD2) completely blocked LPS-induced NO production, while DN-PLD1 did not effect on LPS-induced NO synthesis. Moreover, LPS-induced NO synthesis and expressions of iNOS and COX-2 were blocked by PLD2 siRNA, suggesting that LPS upregulates NO synthesis through PLD2. Next, we examined any differences of mTOR which was reported as a critical mediator in proinflammation mechanism. Therefore, we monitored the phosphorylation of two downstream effectors, p70S6kinase and 4EBP1, of mTOR in response to LPS stimulation. To investigate the involvement of mTOR pathway in LPS-induced NO synthesis, we used rapamycin, mTOR inhibitor. Inhibition of mTOR resulted in decreased NO synthesis and expressions of iNOS and COX-2. The phosphorylation of p70S6kinase and 4EBP1 were also blocked by inhibition of mTOR. However, blocking PLD activity using 1-butanol and PLD2 siRNA resulted in decreased phosphorylation of p70S6kinase, but not 4EBP1. Taken together, the present study suggests that NO synthesis is regulated by PLD dependent manner with involvement of mTOR pathway through p70S6kinase, and among PLD isozymes, PLD2 acts as an important regulator in NO production signal in Raw 264.7 cells