The anti-inflammatory effect of curcumin on ulcerative colitis

Abstract

연구 목적: 궤양성 대장염은 반복적으로 발생하는 일종의 난치성 소화기 계통의 장 질환이다. 임상에서는 흔히 복통, 설사 및 농혈 점액변이 주요한 증상이며 병변은 점막 및 점막하층에 국한 되어있다. 병리학적 소견으로 볼 때 궤양이 형성되고 음와(crypt)에 농양이 생기고 소 혈관염증 그리고 배상세포(goblet cell)의 감소 및 각종 유형의 염증세포가 염색되는 등과 같은 비특이성 표현이 관찰된다. 만성 궤양성 대장염은 장기간 치료에도 잘 낫지 않으며 쉽게 재발되고 엄중한 합병증도 가져오기 때문에 이미 임상치료의 난제중의 하나로 인식되어 왔다. 많은 문헌보고에 의하면 이 병은 유럽이나 미국에서 흔하며 근년에 한국에서도 현저히 증가되는 추세를 보이고 있다. 그러나 이 병의 원인과 발병기전이 복잡하여 아직까지도 정확히 알려지지 않고 있다. 식물성 페놀계 물질인 curcumin은 생강과 (Zingiberaceae) 식물인 turmeric (Curcuma longa)의 주성분으로 인도지역의 음식에 널리 사용되는 노란색 향신료이며 민간요법으로도 사용되어 왔다. 최근에는 이 물질이 항암, 항염증, 항돌연변이 및 콜레스테롤을 저하하는 기능이 있다고 보고가 되었으며 유방암, 간암, 구강암 등에 대한 치료제로서의 사용 가능성에 대한 연구가 심도있게 진행이 되어왔다. 그러나 대장암이나 대장염에 대한 치료제로서의 가능성에 대한 연구는 진행중이다. 그러므로 본 연구는 대장염에 대한 curcumin의 치료효과 및 그 작용기전을 in vitro와 in vivo에서 궤양성 대장염에 관계되는 염증매개인자들에 대한 효과를 연구하여 curcumin의 궤양성 대장염에 대한 응용 전망을 추측하였다. 재료 및 방법: 체외실험: 대장암세포 HT-29와 Caco-2에 부동한 농도와 시간에 따른 curcumin을 처리하여 세포성장 억제 효과를 관찰하고 과산화수소를 처리한 세포에 약물을 처리하여 항산화 효과를 비교 분석하였다. 체내 실험: 흰쥐에서 DSS (Dextran sulfate sodium)으로 유발시킨 궤양성 대장염에 대한 curcumin의 항염증 효과와 작용기전에 대하여 연구하였다. 결과: 1. 과산화 수소에 의하여 생성된 자유라디칼은 대장암 세포인 HT-29와 Caco-2에 산화적 손상을 초래하며, 이러한 손상에 기인된 세포사멸에 대하여 curcumin이 Caco-2 세포에서는 항 산화효과가 없었으나 HT-29세포에서는 항 산화 효과가 있었다. 2. Curcumin의 세포사멸에 미치는 영향을 평가한 결과 농도 및 시간 의존적으로 HT-29 세포사멸을 촉진하였고 Caco-2 에서는 농도 의존적으로 세포사멸을 촉진하였다. 3. Curcumin의 궤양성 대장염 생체실험에서 curcumin의 성장에 대한 억제 혹은 촉진작용을 평가하기 위하여 실험동물의 체중변화를 측정한 결과, DSS로 궤양성결장염을 유발한 모델군의 1일 체중 평균 증가양은 정상 대조군에 비하여 현저히 낮았지만 체중의 감소는 보이지 않았다. 이 결과는 이 시기에 흰쥐가 성장기에 있었기 때문으로 여겨진다. 4. DSS모델 군에서는 DSS투여 3일째부터 정상대조군에 비하여 활동이 현저히 줄어들고 수면시간이 길고 모 광택이 줄어들고 탈모도 보였고 활동도가 떨어지는 증상과 더불어 식이 섭취량이 줄어드는 등 증상을 보였다. 모델 군 3마리에서 묽은 변 증상이 나타났다. 8일째 되는 날에는 모델 군 전부에서 설사증세 및 변 잠혈 양성반응 혹은 혈변 증세를 보였다. 5. 결장의 길이를 관찰한 결과 DSS모델군의 결장의 길이가 정상 대조 군에 비해 짧게 관찰되었다. 6. 결장조직의 H＆E염색에서 DSS모델군은 점막이 충혈되고 부었으며 미란과 궤양이 형성 된 것이 관찰 되였지만 DSS 투여 후 curcumin 투여 군에서는 이상의 병리 조직 표현들이 현저히 완화 되였다. 이 결과로curcumin은 DSS에 의해 유도된 Rat 궤양성 대장염에 현저한 항염증 작용이 있는 것으로 사료된다. 7. 결장 점막에서의 생화학적 지표의 측정결과 DSS 모델군 흰쥐들의 MDA와 PGE₂함량은 다른 군에 비하여 훨씬 높게 관찰되었고 DSS 투여후 curcumin 투여 군에서는 대조군보다 높은 경향을 보였으나 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 8. 면역염색방법으로 결장조직에서 ICAM-1, NF-kB p65, COX-2, iNOS를 관찰한 결과, ICAM-1은 혈관내피세포(vascular endothelia cell)와 대식세포(macrophage)에서 관찰되었고 NF-kB p65는 혈관내피세포의 세포핵(cell nuclear)와 세포질 (cytoplasma), 상피세포에서 많이 관찰되었다. COX-2는 장근육의 신경세포 (myenteric neurons)와 대식세포 에서 관찰되였고 iNOS는 대식세포와 단핵세포 (monocyte)에서 관찰되었다. 9. 정상대조군에 비하여 ICAM-1, NF-kB p65, COX-2, iNOS는 DSS 모델군에서 유의적으로 많이 관찰 되었고 DSS 투여후 curcumin 투여군에서는 상대적으로 적게 관찰되었다. 결론: 본 연구에서 curcumin의 항산화 효과와 세포 사멸 효과를 대장암 세포인 HT-29와 Caco-2 등 두 가지 세포에서 관찰한 결과, curcumin은 HT-29세포에서 과산화수소에 의하여 유도된 산화적 스테레스를 현저하게 억제하였으며, 세포사멸을 효과적으로 유도하였다. 또한, 흰쥐를 사용한 in vivo 실험결과에서 curcumin은 DSS에 의해 유도된 대장염에 대한 현저한 항염증 효과를 나타내었다. 그러므로 curcumin이 항염증 작용이 있고 그 작용기전으로는 여러가지 염증세포들이 염증매개인자와 염증요소들의 발현를 억제함으로서 염증 발생을 억제하는것으로 보여진다.; Ulcerative colitis (UC), is a non-specific inflammatory intestinal disease and its pathogenesis is affected by a variety of factors and is still unknown at present. UC, one of the inflammatory bowel disease (IBD), is increasing in Korea every year. Sulfasalazine and corticosteroid are regularly used to treat IBD, but they have many side effects during long-term use and sometimes no therapeutic effect at all for some patients. Therefore, it is important to explore new medicines that are more effective and have less side effects. Curcumin is the major yellow-orange pigment extracted from turmeric and has anti-carcinogenic, anti-oxidative, and anti-inflammatory activities. This study was to investigate the anti-oxidative effects of curcumin on HT-29 and Caco-2 colon cancer cell line and anti-inflammatory effects of dextran sulfate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis in rats. The effect of curcumin on the growth of human colon cancer cell lines, such as HT-29 and Caco-2 cells were examined. The growth of HT-29 and Caco-2 cells were examined by MTS (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy phenyl)-2H-tetrazolium) cell viability on treatment with 10 uM, 30 uM and 50 uM curcumin from the first day to the third day after seeding to 2×10⁴ HT-29 cells/well and 4×10⁴ Caco-2 cells/well. The results suggested that curcumin inhibited the growth of HT-29 and Caco-2 cells in a dose-dependent manner. Further assessment of anti-oxidative activities (radical scavenging ability) of curcumin was made with MTS cell viability assay in HT-29 and Caco-2 cells that were challenged with hydrogen peroxide (H₂O₂). Curcumin showed the significant protective effects on the H₂O₂-induced oxidative stress in HT-29cells, but did not show in Caco-2 cells. We have also performed to evaluate anti-oxidative activities of curcumin by DSS-induced UC in rats. The colitis rats were induced by drinking water containing 2% DSS for four weeks. The experimental animals were randomly divided into four groups: (ⅰ) control (normal) group (2.5% carboxymethyl cellulose+drinking water), (ⅱ) model group (2.5% carboxymethyl cellulose+DSS-induced ulcerative colitis), (ⅲ) high-dose curcumin treated group [DSS+curcumin (100 mg/kg/day for 7weeks, P.O.)], (ⅳ) low-dose curcumin treated group [DSS+ curcumin (10 mg/kg/day for 7weeks, P.O.)]. For the oral admistration experiments, curcumin was emulsified in 2.5% carboxymethyl cellulose. At the end of experiment, the changes of rat daily body weight gain and colon length were measured. We evaluated pathologically disease activity index (DAI) and colon mucosa damage index (CMDI). The colon mucosa level of malondialdehyde (MDA) was assayed with ultraviolet spectrophotometry. Colonic contents of prostaglandin E₂ (PGE₂) were determined by ELISA kit. The expressions of intercelluer adhesion molecule-1 (ICAM-1), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) proteins in the colonic tissue were detected by immunohistochemistry. The results suggested that the daily body weight gain in DSS treated rat group were lower than control rat group, but no decreasing trends in other rat groups. The length of colon in DSS treated rat group were significantly short than control rat group. The extents of DAI and CMDI, the contents of MDA, PGE₂, as well as the expression of ICAM-1, NF-κB p65, iNOS and COX-2 in the DSS-induced rat model group were showed the highest in those rat groups, and DSS-pretreated and curcumin treated rat groups were showed higher than control rat group, DSS-pretreated and low-dose curcumin treated rat group were showed higher than DSS-pretreated and high-dose curcumin treated rat group. In conclusion, the present study demonstrated that curcumin have inhibitory effects on the growth of HT-29 and Caco-2 cells and alleviates inflammatory response in DSS-induced ulcerative colitis rat. Interestingly enough, this study suggested that curcumin may have significant inhibitory effects on the H₂O₂-induced oxidative stress in the HT-29 cells. And the therapeutic effect of curcumin may possibly result from anti-oxidative activity of HT-29 cell line and anti-inflammatory activity on the rat model colitis induced by DSS.