담낭상피세포주와 인체담낭조직에서 Toll-like receptor 의 발현

Abstract

배경: 담낭 상피 세포는 지속적으로 외부 자극이나 많은 세균에 노출되어 있으며 계속적인 항원 자극에 대한 염증반응을 조절 하는 면역체계가 관여할 것으로 생각한다. 원발성 담도성 간경변증, 원발성 경화성 담도염, 이식거부반응 같은 담도계의 만성 염증이나 담도암의 발생기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만 이러한 반복적인 외부자극에 대한 담도계 상피세포의 면역반응이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 인체에서 선천면역과 적응면역에 중요한 역할에 관여하는 것으로 알려진 Toll-like receptor에는 현재까지 13개의 아형이 알려져 있고, 사람의 담도 상피세포에서도 다양한 Toll-like receptor가 발현되며, 이중 TLR2와 TLR4 가 담도 세균감염에 대한 선천면역에 중요한 역할을 한다. 목적: 정상 인체 담낭 상피세포 조직과 염증을 동반한 인체 담낭 상피조직에서 TLR 2와 TLR 4의 발현을 확인하고, 그람 음성균의 산물인 LPS 노출에 따른 담낭상피세포의 염증 정도의 변화와 TLR2, TLR4, IL-8의 발현 변화를 알아보았다. 또한 UDCA 전 처리에 따른 TLR의 변화를 알아보고자 하였다. 방법: 인체 담낭조직은 정상 담낭 조직, 담석을 동반한 급성 담낭염, 담석을 동반한 cholesterolosis 그리고 콜레스테롤 용종의 담낭 조직을 사용하였고, in vitro 실험에서는 개담낭상피세포주 (Dog Gallbladder epithelial cell line), 인체담도암세포주 (Human GB-1), 인체담낭암세포주 (Human CC-t6)를 사용하였다. 인체 조직에서 TLR2, TLR4의 발현은 면역조직화학검사, western blot, Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)로 알아보았으며, in vitro 실험에서는 개 담낭상피세포주에 Lipopolysaccharide (LPS) 를 전 처리 한 후 western blot 과 RT-PCR로 TLR2, TLR4, IL-8의 발현 정도를 확인하였다. UDCA를 전 처리한 후 TLR4 발현 변화는 RT-PCR로 확인 하였다. 결과: 1. 인체담낭상피세포 조직에서 시행한 면역조직화학 염색과 western blot 에서 동일하지는 않지만 모두 TLR2, TLR4이 발현 되었다. 이 중 염증 반응이 심한 담석을 동반한 급성 담낭염과 담석을 동반한 cholesterolosis 환자의 담낭상피세포에서 TLR2, TLR4의 발현이 다른 정상 담낭상피세포 보다 증가했으며 모든 담낭 상피세포에서 TLR 4의 발현이 TLR 2보다 증가 하였다. 2. 개담낭상피세포는 염증 반응이 심해 질수록 (LPS 농도가 증가하고 노출된 시간이 길어 질수록) TLR4, IL-8의 발현 정도가 증가하였다. 그러나 LPS 농도와 노출된 시간에 따른 TLR2 변화는 없었다. 3. UDCA를 전 처리한 군에서 대조군에 비해서 TLR 4의 발현이 증가하였지만, LPS로 염증반응을 유발하였을 경우에는 UDCA를 전 처리한 군에서 UDCA를 치료하지 않은 군에 비해 TLR4발현이 감소하였다. 결론: 담석을 동반한 급성 담낭염과 만성적인 염증성 변화가 동반된 콜레스테롤 용종 등의 담낭 염증성 질환에서 TLR2, TLR4가 외부 항원의 인지를 통한 선천면역에 중요한 역할을 하며, 특히 그람 음성 세균벽의 구성 성분인 LPS를 인지하는 TLR4가 중요한 역할을 담당한다. 외부자극 특히 그람 음성 세균에 노출된 담낭 상피 세포에서 UDCA 치료는 TLR4의 발현을 감소 시켜 항 염증작용을 하는 것으로 생각 된다.; Expression of Toll-like Receptor in the Biliary Epithelial Cell Lines and Human Gallbladder Tissues Backgrounds: Biliary epithelial cells are targets of immune-mediated attack by various bacterial pathogens such as E. coli. It is unclear which immune mechanism involves in chronic biliary inflammation and malignant transformation. Toll-like receptors (TLR) which initiate innate immune response consist of 13 subtypes. TLR2 and TLR4 are major receptors for Gram-positive and Gram-negative bacterial cell wall components, respectively. Aims; we investigated the expression of TLR2 and TLR4 in human gallbladder (GB) tissues in conditions such as cholecystitis with gall stones, cholesterol polyp and normal control and also investigated the response of TLR2 and TLR4 and IL-8 by lipopolysaccharide (LPS) stimuli and the response of TLR4 by ursodeoxycholic acid(UDCA) stimuli in dog GB epithelial cell lines Methods: Expression of TLR2 and TLR4 protein was demonstrated by western blotting and immunohistochemical stain. expression of TLR4 mRNA transcription was demonstrated by RT-PCR. Results: 1.TLR2 and TLR4 protein in human GB tissues showed ubiquitous expression, but expression of TLR2 and TLR4 protein in inflamed GB with stones or polyps increased more than in normal GB tissues. TLR4 mRNA also increased in inflamed GB. 2.Expression of TLR4 protein increased gradually by LPS stimuli (0, 100, 200 ㎍/ml) for 4 hr, 8 hr and 24 hr in the Dog GB cell lines. Expresssion of TLR2 protein didn…t show any change by LPS concentration or duration. 3.UDCA treatment decrease TLR4 expression in Vitro experiment Conclusion: TLR play an important role of inflammation in the biliary epithelium. Especially, TLR4 as a ligand that recognized LPS on Gram-negative bacterial wall increased in the inflammed biliary epithelium. UDCA treatment will decreased expression of TLR 4 in inflammed biliary epithelium. But, relationship between expression of TLR4 and UDCA stimuli was still remained unclear.