흰쥐의 간에서 하지의 반복적인 허혈양상화에 의한 heat shock protein과 nitric oxide synthase 변화

Abstract

허혈양상화(ischemic preconditioning)는 짧은 허혈 자극을 주어 장시간의 허혈 및 재관류에 의한 조직 손상을 감소시키는 현상이다. 허혈양상화의 보호 효과는 두 단계로 나타나는데, 초기 허혈 손상 후 수 분 내에 발생하여 2시간에서 3시간까지 지속되는 초기 보호단계와 12시간에서 24시간 뒤에 발생하여 3일까지 지속되는 후기 보호단계로 나눌 수 있다. 다리에서 짧은 허혈을 유도하면 멀리 떨어진 간에서의 허혈 및 재관류에 의한 내피세포 손상과 염증을 감소시킬 수 있다. 이를 원거리 허혈양상화(remote preconditioning)라고 한다. Heme oxygenase-1 (HO-1)은 열충격단백질(heat shock protein; HSP) 32로 알려져 있다. HO-1이 과발현되면 허혈 및 재관류 손상으로부터 간세포를 보호한다. HSP70은 정상적으로 발현되지만, 고열이나 허혈과 같은 수많은 손상 자극에 의해 발현이 증가하며, HSP70의 발현이 증가하면 세포자멸사를 억제시킬 수 있다. 산화질소(nitric oxide; NO)는 산화질소합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 발생된다. endothelial NOS (eNOS)에 의해 발생된 NO는 혈관이완제로 작용하여 혈관의 항상성을 유지하지만, inducible NOS (iNOS)에서 발생된 NO는 과도하게 증가하면 세포에 해로운 영향을 끼친다. 이에 저자는 흰쥐의 하지 허혈양상화의 반복 횟수에 따라 재관류 후 간에서 HO-1, HSP70, eNOS, iNOS 단백질이 어떻게 발현되는지를 알아보고자 본 실험을 실시하였다. 35주령의 흰쥐를 사용하여, 왼온엉덩동맥에서 5분씩 허혈과 재관류를 실시하여 허혈양상화 처치를 하였고, 허혈양상화는 3회와 10회 반복하였다. 허혈양상화 처치 후 재관류 0, 3, 6, 24, 72시간 후에 간에서 발현되는 HO-1, HSP70, eNOS, iNOS 단백질의 변화를 알아보고자 면역조직화학염색과 Western blotting을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 간 조직에서 HO-1의 발현은 하지 허혈양상화를 3회와 10회 반복한 후 재관류 72시간에 정상대조군보다 유의성 있게 증가하였다. 2. 간 조직에서 HSP70의 발현은 하지 허혈양상화를 3회 반복한 후 재관류 6시간에 정상대조군보다 증가하였고, 재관류 72시간에는 정상대조군과 비슷하였다. 10회 반복한 경우에는 재관류 직후에 정상대조군보다 증가하였고, 재관류 24시간과 재관류 72시간에는 정상대조군보다 유의성 있게 감소하였다. 3. 간 조직에서 eNOS의 발현은 하지 허혈양상화를 3회와 10회 반복한 후 모든 재관류 시간에서 정상대조군보다 증가하였으나, 3회 반복은 재관류 6시간에 최대로 증가하였고, 10회 반복은 재관류 24시간에 최대로 증가하였다. 4. 간 조직에서 iNOS의 발현은 하지 허혈양상화를 3회와 10회 반복한 후 재관류 24시간에 정상대조군보다 유의성 있게 증가하였으나, 재관류 72시간에 감소하였다. 10회 반복은 재관류 3시간과 6시간에 정상대조군보다 유의성 있게 감소하였다. 본 실험결과를 종합해보면, 흰쥐의 왼온엉덩동맥에서 짧은 허혈과 재관류를 실행하면 재관류 초기에는 간 조직에서 eNOS와 HSP70의 발현이 증가하였고, 재관류 후기에는 HO-1과 iNOS의 발현이 증가하였다.; Ischemic preconditioning (IP), short pre-treatment sublethal ischemia, induces a state of protection against subsequent prolonged ischemia-reperfusion. Short periods of limb ischemia induce remote preconditioning, prevent ischemia-reperfusion-induced endothelial dysfunction and reduce inflammation in liver in experimental aminals. Ischemic preconditioning is a biphasic phenomenon. The early phase of protection develops within minutes from the initial ischemic insult and lasts 2 to 3 hours, the late (or delayed) phase becomes apparent 12 to 24 hours later and lasts 3 days. Nitric oxide (NO) is generated by a family of nitric oxide synthase (NOS) enzymes. Endothelial NOS (eNOS)-derived NO exerts a variety of biological functions, including vasodilation and inducible NOS (iNOS)-derived NO can upregulate HO-1. Heme oxygenase-1 (HO-1) is an inducible heat shock protein (HSP) 32. Overexpression of HO-1 exerts potent cytoprotective effects in rat hepatic ischemia-reperfusion models. HO-1 inducer treatment upregulates liver HO-1 with a downregulation of iNOS expression. The HSPs are expressed in normal cells but their expression can be increased by a number of injury stresses, such as heat and ischemia, thus can inhibit apoptosis. Also, HSP70 confers protective effects on the oxidative stress response. The purpose of this study was to investigate the expression of HO-1, HSP70, eNOS, iNOS proteins in the liver subjected to the courses of reperfusion after repetitive cycles of hindlimb ischemic preconditioning in the rat. Using thirty five week-old rats, the remote preconditioning was undertaken by vascular clamp occlusion of blood flow to one hindlimb, with 3 and 10 cycles of 5 minutes occlusion followed by 5 minutes reperfusion. The liver was removed 0, 3, 6, 24 and 72 hours of reperfusion after remote hindlimb ischemic preconditioning and assayed by immunohistochemical staining and Western blotting analyses. for anti-HO-1, anti-HSP70, anti-eNOS, anti-iNOS antibodies. The results obtains were as follows: 1. The expression of HO-1 in rat liver increased at 72 hours of reperfusion groups after 3 and 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. 2. The expression of HSP70 in rat liver increased at 6 hours of reperfusion groups after 3 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups and was similar at 72 hours of reperfusion groups after 3 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. The expression of HSP70 in rat liver increased at 0 hour of reperfusion groups after 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups and decreased at 24 and 72 hours of reperfusion groups after 3 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. 3. The expression of eNOS in rat liver increased at all of reperfusion groups after 3 and 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. But, the expression of eNOS in rat liver most increased at 3 hours of reperfusion groups after 3 cycles of hindlimb ischemic preconditioning and most increased at 24 hours of reperfusion groups after 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning. 4. The expression of iNOS in rat liver increased at 24 hours of reperfusion groups, but decreased at 72 hours of reperfusion groups after 3 and 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. The expression of iNOS in rat liver decreased at 3 and 6 hours of reperfusion groups after 10 cycles of hindlimb ischemic preconditioning, compared with normal control groups. In conclusion, these results suggest that eNOS and HSP70 expression may be increased at early phase of reperfusion after hindlimb ischemic preconditioning in rat liver. But, HO-1 and iNOS expression may be increased at late phase of reperfusion after hindlimb ischemic preconditioning in rat liver injury.