담석증 환자의 담낭담즙으로부터 분리된 병원성 미생물 및 항생제 내성 세균에 대한 항생펩타이드의 항생 효과

Abstract

Introduction: The appearance of antibiotic resistant strains has made the search for more potent and efficient drug necessary. Antimicrobial peptides generally show a wide spectrum of antimicrobial activities and act against certain parts of microbial cell membranes. To develop novel antimicrobial peptides useful as therapeutic drugs the analogues were designed to increase not only net positive charge by Lyssubstitution but also hydrophobic helix region by Leu-substitution from cecropin A(1-8)magainin 2(1-12)〔CA-MA〕hybrid peptide. In particular, CA-MA analogue P5, designed by flexible region (GIG→P)-substitution, Lys-(positions 4, 8, 14, 15) and Leu-(positions 5, 6, 12, 13, 16, 17, 20) substitutions, showed an enhanced antimicrobial and antitumor activity without hemolysis. Methods: In this study, we tested the effects of P5 against pathogens from patients with cholelithiasis. Hemolytic activity and survival rate against human keratinocyte cell (HaCaT) of P5 were evaluated. To investigate the mechanism of action of P5, we performed confocal laser scanning microscopy using pathogens from the gallbladder bile in patients with cholelithiasis. We also tested antibacterial activity and synergistic effect against isepamicin, flomoxef sodium or cefpiramide-resistant bacterial cell lines. Results: By determining their 16S rDNA sequences, we found that both the pathogens from patients with cholelithiasis and the resistant cell lines showed 100% homology with sequences from Pseudomonas aeruginosa and Sphingomonas yabuuchiae GTC 868T. We found that P5 displayed strong activity against pathogens from patients with cholelithiasis, but it did not have hemolytic activity against human erythrocytes. We also found that P5 had potent activity against isepamicin, flomoxef sodium or cefpiramide-resistant bacterial cell lines, and that P5 and antibiotics had synergistic effects against cell lines resistant to the latter. Scanning electron microscopy showed that P5 caused significant morphological alterations in the cell surface of pathogens from patients with cholelithiasis. Conclusion: These results suggest that P5 has antibiotic activity and that it may be used as a lead drug for the treatment of acquired pathogens from patients with cholelithiasis and antibiotic-resistant cell lines.; 서론: 항생제에 내성을 갖는 균주들이 등장하면서 보다 강력하고 효과적인 약물개발에 대한 연구가 절실해졌다. 자연계 생물로부터 얻어지는 항생펩타이드가 광범위한 항균 활성을 보이며 대부분 세포막에 작용한다는 것이 알려지면서 새로운 약물개발 등의 연구에 이용되고 있다. 본 연구에서는 P5라는 합성 항생펩타이드를 이용하여 담석증 환자의 담낭담즙으로부터 분리된 항생제 내성 미생물에서 그 항균 활성과 작용 기작을 확인하였다. 대상 및 방법: Cecropin A(1-8)Magainin 2(1-12)로부터 GIG→Pro, L₄→K₄, F_(5)→L_(5), K_(6)→L_(6), I_(8)→K_(8), K_(12)→L_(12), F_(13)→L_(13), L_(14)→K_(14), H_(15)→K_(15), S_(16)→L_(16), A_(17)→L_(17), F_(20)→L_(20) 치환 등의 방법으로 P5를 설계하였다. P5의 세포 독성을 확인하기 위해 인간 적혈구 용혈력(hemolytic activity)과 인간 각질세포(human keratinocyte cell) 생존율을 평가하였다. 담즙 감염 미생물에 대한 항균 활성 부위를 확인하기 위해 P5에 형광물질을 부착한 후 confocal laser scanning microscopy를 이용하여 확인하였다. 또한 여러 항생제에 내성을 보이는 담즙 균주에 P5의 항생 효과와 항생제 상승효과를 확인 하였다. 결과: 16S rDNA gene sequence를 이용하여 담즙으로부터 Pseudomonas aeruginosa, Sphingomonas yabuuchiae GTC 868T, Pseudomonas sp.가 분리되었다. P5는 강력한 항균 활성이 있었으나 세포 독성을 확인하기 위해 시행한 적혈구 용혈검사에서는 전혀 용혈반응을 보이지 않았다. 여러 항생제에 내성을 보이는 균주에 대해서도 우수한 항균 효과를 보였고 저항을 보이는 항생제에 P5 최저억제농도 절반만 투여하여도 우수한 상승효과를 보였다. 이는 주사전자현미경을 이용해 세균의 세포 표면이 형태적인 변화가 초래됨을 통해 확인할 수 있었다. 결론: P5는 항생 효과를 가지고 있고 여러 항생제에 내성을 보이는 병원성 균주에 대해서도 우수한 항균 효과와 항생제 상승효과가 뚜렷하여 향후 새로운 약물 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.