생쥐 및 인간 배아줄기세포의 특성 유지에 대한 기능유전체학

Abstract

다세포 생명체로의 형성은 발생, 분화라고 불리는 과정에 의해 완성된다. 대개의 경우, 수정란 혹은 접합자라 불리는 하나의 세포의 증식 및 분화 과정을 거쳐 하나의 개체로 형성된다. 줄기세포는 하나의 세포로 이루어져 있으며, 이의 증식과 분화과정을 거쳐 배아 또는 성체를 구성하는 여러 가지 세포로 분화한다. 이런 이유로, 최근 임상적 응용을 위한 줄기세포를 대상으로 한 연구의 필요성이 대두되고, 몇몇 연구자에 의해서 연구가 진행되고 있는 상태이다. 그러나, 임상적 응용을 위한 줄기세포 연구는 미진한 상황이며, 줄기세포의 전능성 유지에 대한 연구와 지식들은 부족한 상태이다. 이에, 줄기세포의 전능성 유지 및 분화에 대한 분자적 기작을 이해하기 위하여, 미분화 혹은 분화된 생쥐 및 인간 배아줄기세포에서 cDNA microaray를 이용한 연구를 진행하였다. 제 1 장에서는, 생쥐와 인간 배아줄기세포의 유지와 분화 과정에 대한 분자적 기작을 이해하고자, cDNA microarray를 이용하여 대단위적인 유전자 발현 양상을 분석하였다. Hierarchical clustering 및 통계학적 방법을 이용하여, 생쥐 및 인간 배아줄기세포의 분화 과정 중 특정 시기에 보여지는 유전자 발현 양상과 이에 해당하는 유전자 군집들을 동정하였다. 분화 유도 후 120시간까지의 생쥐 배아줄기세포에서, 분화 후 0, 12, 24와 72시간이 지난 생쥐 배아줄기세포의 유전자 발현양상이 유사한 군집을 형성하는 것을 hierarchical clustering을 통해 확인하였으며, 나머지 36, 48, 96과 120시간 후의 유전자들도 그 발현양상이 유사한 군집을 이루고 있었다. 또한 k-mean clustering 방법을 이용하여, 분화중인 생쥐 배아줄기세포에서의 유전자 발현 양상이 분화 과정 중 동요한다는 것을 확인하였다. 미분화, 분화 5일째, 9일째 및 20일째 인간 배아줄기세포에서는 분화 9일째와 21일째의 유전자 발현 양상이 유사하였다. 또한, 인간 배아줄기세포의 유지와 분화에 관련되는 새로운 유전자들을 동정하였다. 추후 동정된 유전자들의 세포내 기능에 대한 연구는 배아줄기세포의 유지와 분화에 대한 기작을 이해하는데 중요한 지식을 제공해 줄 것이다. 제 2 장에서는, 제 1 장의 인간 배아줄기세포에 대한 cDNA microarray 결과를 바탕으로 하여, 인간 배아줄기세포의 유지와 분화에 관련될 것이라 추측되는 spa-1에 대한 기능을 분석하였다. Spa-1은 혈액전구세포에서 Rasproximate 1 (Rap1) GTPase-activating 단백질로 알려져 있으며, Rap-1과 관련된 신호전달에 관여하는 것으로 알려졌다. 또한 인간 성체에서는 골수, 흉선 및 비장등의 제한된 조직에서만 발현한다. 인간 배아줄기세포에서 spa-1의 기능을 분석하기 위하여 분화중에서의 spa-1 발현 양상 확인 및 RNA 간섭 방법 (RNA interference, RNAi)을 이용한 spa-1 발현 억제를 수행하였다. 그 결과, 미분화 상태의 인간 배아줄기세포에서 Spa-1의 발현양은 증가하고, 분화될수록 그 발현양은 감소하는 양상을 보였다. 또한 미분화 상태에서의 spa-1 신호전달은 Rap1/Raf/mitogen-activated protein kinase kinase (MEKK)/extracellular signal-related kinase (ERK)을 통해 이루어짐을 확인하였다. Spa-1에 대한 RNAi 발현 벡터가 도입된 인간 배아줄기세포는 미분화 유지를 위한 배양 조건을 제공했음에도 불구하고 분화되는 양상이 관찰되었다. 그러므로, spa-1과 이와 관련된 신호전달 기전은 인간 배아줄기세포의 유지 및 분화를 조절하는 메커니즘으로 사료되며, 이는 앞으로의 줄기세포 연구에 있어서 기초적인 정보가 될 수 있을 것이다. 결과적으로, 줄기세포의 특성 유지 및 분화에 대한 분자적 기전을 알기 위해, 생쥐 초기배아, 생쥐 및 인간 배아줄기세포에 대해 cDNA microarray를 이용한 대단위적인 유전자 발현 양상을 분석하고, 해당 유전자에 대한 기능적 분석을 실시하였다. 본 연구를 통하여, 생쥐 및 인간 배아줄기세포의 미분화 혹은 분화 상태에서의 유전자 발현 양상을 확인하였다. 배아줄기세포의 분화 중, 각 유전자의 상호 복잡한 조절에 의한 유전자의 특이적 발현은 정상적인 분화를 가능케 하는 것으로 판단된다. 상기 유전자들 중, spa-1은 Raf-1 혹은 B-raf의 활성을 통해 배아줄기세포의 미분화 혹은 분화 모드를 조절하는 것으로 사료된다. 줄기세포를 세포 치료등과 같은 의학적 치료 방법에 응용하기 위하여, 더 많은 연구가 필요할 것이다.; Multicellular organisms do not spring froth fully formed. Rather, they arise by a relatively slow process of progressive change that we call development. In nearly all cases, the development of a multicellular organism begins with a single cell, the fertilized egg, or zygote, which divides mitotically to produce all the cells of the body. The ultimate stem cell, the fertilized egg, is a single cell that can give rise to progeny that differentiate into any of the specialized cells of embryonic or adult tissues. Recently, knowledge of stem cells has progressed rapidly and experimental therapies are alrealy in clinical trials. However, there are many more questions than answers and we need a better understanding of the biology of stem cells. Also, physological studies for maintenance of pluripotency or stemness provide us important clues for understanding of stem cells. A better understanding of stem cell biology may lead us not only to new approaches of cell therapy or cell rescue, but also to new techniques of medical application. To understand the fundamental mechanisms underlying the pluripotency or stemness, we identified genes involved in the control of stem cell pluripotency and differentiation of mouse and human embryonic stem cells using cDNA microarray and then characterized one of them, signal-induced proliferation-associated gene-1 (spa-1), specifically for its role in genetic pathways involved in the decision of stem cell differentiation. In chapter I, to delineate the molecular mechanisms involved in the maintenance of pluripotency and the early molecular events which occur during the differentiation of mouse and human embryonic stem cells, we examined global changes of gene expression patterns in differentiating mESCs, and hESCs. Using cDNA microarrays, we identified groups of genes differentially expressed at specific time points of mESCs and hESCs differentiation by ANOVA and hierarchical clustering analyses. In mESCs, global gene expression profiles analyzed with hierarchical clustering place cells at 0, 12, 24 and 72 hrs of differentiation in one group in the 2-way hierarchical clustergram, whereas those at 36, 48, 96 and 120 hrs of differentiation were in another group. The k-means clustering analysis revealed large-scale oscillation of gene expression during differentiation of mESCs. In hESCs, oscillation of gene expression were observed, transcriptome of 9-day EB was more similar to that of 20-day EB than 5-day EB. Also, we found several marker genes that were notified us of self-renewal and differentiation of hESCS. Taken together, our data not only provide information for the study of stem cell pluripotency and mammalian early embryogenesis but also reveal that oscillating patterns of gene expression occur intrinsically during mESC and hESCs differentiation. In chapter II, we characterized a gene, signal-induced proliferation-associated gene-1 (spa-1), which was identified as an overexpressed gene in undifferentiated hESCs compared to differentiated hESCs by screening genes using the oligo DNA chip. Spa-1 is a principal Ras-proximate 1 (Rap1) GTPase-activating protein in hematopoietic progenitor cells that regulates Rap1-related signal transduction and is expressed restrictively in human adult tissues (bone marrow, thymus, and spleen). To investigate its functions in hESCs, we examined spa-1 expression profiles during hESC differentiation and used RNA interference (RNAi) to downregulate spa-1 in these cells. Our results show that Spa-1 is expressed in undifferentiated hESCs and is downregulated during hESC differentiation. In addition, the process of passing from the mode of self-renewal to that of differentiation in hESCs was regulated by spa-1 via Rap1/Raf/mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-related kinase signaling. An RNAi expression vector against spa-1 (pSUPER.retro.puro) was transfected into hESCs, which were seen to differentiate into germ layers in spite of being in the undifferentiated condition. Based on our findings, therefore, it appears that spa-1 may be involved in hESC dynamics, and our results provide fundamental information regarding the self-renewal and differentiation of hESCs. In summary, to know molecular mechanisms of stemness, we analyzed gene expression profiles in mouse and human embryonic stem cells by cDNA microarray. We observed oscillating pattern of gene expresion during differentiation of mouse or human embryonic stem cells, and identified several smart genes that involved in the regulation of self-renewal and dfferentiation in morula-blstocyst transition or stem cells were isolated. Among them, spa-1 is expressed in hESC lines and regulates Rap1 activity by modulating the activities of Raf-1 or B-raf, thus determining whether cells enter the self-renewal or differentiating mode. For application of stem cell therapy and medical techniques, further molecular mechanisms underlying the activity of key molecules in the maintenance and differentiation of hESCs should be clearly established.