해마신경세포에서 신경세포가소성에 관련된 새로운 신경활성분자들에 대한 연구

Abstract

축삭재생이나 새로운 신경회로의 생성같이 구조적측면에서 일어나는 가소성 (structural plasticity)과 LTD (long-term depression) 나 LTP (long-term potentiation) 같은 신경세포간 연접부위에서 전기화학적 신호전달의 효율이 변하는 신경연접가소성 (synaptic platicity)은 신경세포가 제 기능을 하기 위한 필수요건이다. 본 연구에서는 synaptic plasticity와 관련해 혈관생성인자로 알려진 VEGF (vascular endothelial growth factor) 의 neurotrophic factor로서의 가능성을 탐구하고 다음으로는 신경세포생성과 관련해 mammalian SWI/SNF chromatin remodeling complex의 core subunit인 SRG3유전자가 신경생성에서 차지하는 역할을 성체해마신경생성 (adult hippocampal neurogenesis)과 연관 지어 탐구한다. 이를 위해 이 유전자가 과발현된 mouse를 대상으로 면역조직학적 방법 및 분자생물학적방법을 이용해 신경발생의 여러단계를 조사하고 아울러 장기간 스트레스호르몬에 노출되었을 때 과발현된 SRG3유전자가 새로 생성된 신경세포의 생존에 어떠한 영향을 미치는지를 조사한다. 마지막으로 현재진행중인 연구로서, 신경세포에서 유전자발현의 조절과 관련해 히스톤 단백질의 탈아세틸화를 억제하는 HDAC (Histone deacetylase) inhibitor들이 성체해마신경생성과 관련해 어떠한 역할을 할 수 있는지를 새로이 태어난 신경세포의 생존적 측면에 초점을 맞추어 탐구한다. 해마신경세포를 KCl로 탈분극시키면 VEGF단백질의 발현및 신경세포로부터의 분비가 시간 의존적으로 증가한다. 이러한 신경활성 의존적 VEGF발현증가에는 NMDA receptor 와 L-VACC(L type voltage activated calcium channel)에 의한 calcium influx가 관여한다. 또 VEGF를 해마신경세포에 처리하면 PLCr pathway를 통해서 세포내 calcium store로부터 분비되어 나온 calcium 이온이나 TRPC channel를 통한 calcium influx에 의해 세포내 calcium농도가 증가하며, 해마 slice에서 Flk-1 receptor를 경유하여 long-term synaptic enhancement가 일어난다. 이러한 VEGF의 작용은 세포내에서 extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) 경로와 mammalian target of rapamycin (mTOR) 경로, 그리고 calcium/calmodulin protein kinaseII (CaMKII) 의 활성화를 통해서 이루어진다. mouse SWI/SNF chromatin remodeling complex의 한 subunit인 SRG3유전자가 homozyous/heterozyous knock-out되면 embryo 단계에서 사망하거나 신경계발생에 문제가 생긴다고 알려져 있다. 해마를 포함한 전뇌영역 (forebrain)의 신경세포에서 이 유전자가 과발현되는 adult SRG3 TG mouse에서 신경발생의 단계별 marker 유전자를 이용한 면역염색결과, 증식 (BrdU incorporation실험)과 신경분화의 초기(Dcx, PSA-NCAM, Tuj-1 염색결과)/후기(MAP2, NeuN염색결과)단계에서 wild type 대비해 성체해마의 신경생성에 두드러진 차이가 없다. Western immunoblotting결과에서도 해마신경세포의 생존과 관련된 ERK1/2 경로와 CaMKII, CREB 활성경로에서 wild type에 대비해 큰 차이가 없었다. 또 SRG3 TG mouse에 2주간 dexamethasone을 투여했을 때 해마에서 BrdU+인 신경세포 수에 큰 차이가 없는 걸로 미루어 적어도 postmitotic 단계에서 신경세포에서 과발현된 SRG3단백질은 신경세포의 생존에 큰 영향을 못미치는 것 같다. 성체해마에서 새로 태어난 신경세포들은 neuronal activity 에 의한 plasticity증가에 의해 그 생존이 증가하고 그러한 plasticity 증가에는 히스톤단백질의 아세틸화가 관여한다고 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 HDAC inhibitor처리에 의한 히스톤단백질의 아세틸화 증가가 해마신경세포의 생존에 어떤 영향을 미치는 지 조사하였다. mouse에 증식marker인 BrdU를 injection한 후 7일째부터 일주일간 valproic acid (VPA)와 sodium butyrate (SBt)를 주사한 결과 각각 116%, 120%의 생존율 증가를 보였다. 배양된 분화초기 mouse 신경세포에 HDAC inhibitor를 처리하면 CREB의 인산화가 증가되며 특히 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현이 증가되는 걸로 미루어보아 이러한 생존율증가에 antiapoptotic molecule의 발현증가가 관여하는 것 같다. Bcl-2와 Bcl-xL 의 발현증가에 HDAC inhibitor가 구체적으로 어떻게 관여하는 지 그리고 새롭게 태어난 신경세포의 장기생존과 그 기능에 어떠한 영향을 미치는 지에 대한 연구는 현재 진행 중이다.; Plastcity is a requisite for neurons to properly function in response to changing environments. Neural platicity is composed of synaptic plasticity such as LTP or LTD and structural plasticity such as neurogenesis. Regarding synaptic plasticity in hippocampal neurons, vascular endothelial growth factor (VEGF), one of typical angiogenesis-related factors, was investigated for its potential as another neurotrophic factor. With respect to structural plasticity, the role of forebrain-specifically overexpressed SRG3 (SWI3-related gene) in adult hippocampal neurogenesis was first investigated with focus on survival of newborn hippocampal neurons in transgenic (TG) mice overexpressing SRG3 when exposed to subchronic dexamethasone. Next, it was investigated whether histone modifications by histone deacetylase (HDAC) inhibitors could regulate expressions of genes implicated in survival of newborn neurons and thus affect adult hippocampal neurogenesis through increasing survival rate of newborn hippocampal neurons. Similar to typical neurotrophic factors such as BDNF or NGF, both activation and release of VEGF were increased activity-dependently and receptor-specifically. Exogenous VEGF also led to increase of synaptic efficacy at CA1 neurons of hippocampus, causing LTP at postsynaptic neurons. This effect was mediated in part through activation of intermediates of ERK and PI3K signaling cascades as well as CaMKII. SRG3 is a core subunit of a mouse SWI/SNF chromatin remodeling complex and known to play a role in developmental neurogenesis. However, overexpression of SRG3 protein in hippocampal neurons made no significant influence on the entire process of adult hippocampal neurogenesis including proliferation, differentiation, and survival. In addition, survival of newborn neurons in SRG3 TG mice suffered no significant impairment as compared to wild type mice by 2 weeks of dexamethasone treatment. Histone modifications are mainly responsible for neuronal plasticity by neuronal activity which is known to increase survival rate of newborn hippocampal neurons. When HDAC inhibitors such as valproic acid (VPA) and sodium butyrate (SBt) were administered for one week to neurons of 7 days of birth, they actually increased survival rate of newborn neurons in adult hippocampus. The identities of molecules responsible for this effct are being explored with focus on anti-apoptotic Bcl-2 family members, Bcl-2 and Bcl-xL.