rHBsAg가 고정된 자성미세입자를 이용한 rHBsAg 항체의 단단계 분리정제

Abstract

자력을 이용한 분리기술의 장점을 이용하여 여러 가지 불순물들이 섞여 있는 현탁 용액으로부터 자성입자를 이용하여 목적 항체만을 얻어 낼 수 있는 기술의 가능성에 대하여 알아보고자 하였다. 자성입자를 이용하는 경우에는 자성입자 표면에 리간드 고정화, 리간드와 목적 항체와의 특이적 결합, 자력을 이용한 자성입자의 분리, 목적 항체의 탈착, 자성입자의 재사용 순서로 진행되어 여러 단계의 공정을 단순화 시킬 수 있다. 이러한 자성입자를 이용한 방법은 효율성, 단순성, 까다롭지 않은 조건, 자동화의 용이성, 비용의 저렴함으로 인해 관심이 증대되고 있다. 본 연구에서는 표면이 아민기로 코팅된 자성입자에 rHBsAg를 고정시킨 후 rHBsAg 항체를 분리해내고자 하였다. 이를 위하여 자성입자 표면에 다른 물질과의 비특이적 결합이 일어나지 않을 조건에 대하여 확인해 보았다. 또한 rHBsAg의 고정화 밀도를 최적화 시켜 자성입자가 rHBsAg 항체와 보다 효과적으로 결합하여 선택적으로 분리해 낼 수 있는지에 대하여 알아보았다. 3 μg/mg-MP의 rHBsAg의 고정화 밀도와 PEG 블록킹을 사용하였을 경우 비특이적 흡착을 줄일 수 있었으며, rHBsAg가 고정된 자성입자를 사용할 경우 목적 단백질인 rHBsAg 항체와 선택적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 거대분자인 rHBsAg를 리간드로 사용할 경우 rHBsAg 항체에 대한 회수율을 향상시키고자 절단된 펩타이드 절편을 리간드로의 사용 가능성에 대해 평가하였다. rHBsAg의 절단의 경우 trypsin보다 pepsin이 더욱 적절한 단백분해효소임을 확인하였으며, SPR biosensor를 통하여 펩타이드 절편 중 epitope 부분을 포함하고 있는 절편이 존재한다는 것을 확인하였다.; Single step purification by using magnetic particles may consist of the following sequential steps: immobilization of ligand on the surface of magnetic particles, specific biorecognition and interaction between the ligand and the target antibody, separation of magnetic particles by applying a magnetic force, washing and desorption of the captured target antibody from magnetic particles and recycle of the magnetic particles. Recent technical advances in biorecognition engineering and microparticle fabrication may enable us to develop the single step purification by using magnetic particles to the industrial level, because of its simplicity, efficacy, ease of automation and process economics. In this study we used commercial magnetic particle from Chemagen Biopolymer Technologie AG (Baesweiler, Germany). It was about 2 μm in diameter and its surface had amine groups. The model, target antibody was anti-rHBsAg antibody and rHBsAg was used as the ligand molecule. We studied the difference conditions of reducing non-specific binding on the surface of the magnetic particles. And we also studied the possibility of effective immunobinding and selective capturing anti-rHBsAg antibody by optimizing the immobilized rHBsAg density. At ca. 3 μg/mg-MP of immobilized rHBsAg density and PEG blocking, we could reduce the non-specific adsorption. rHBsAg immobilized magnetic particles selectively captured anti-HBsAg antibody with about 60% yield. And we checked the possibility of using digested peptide fragments as a ligand in order to improve the yield. Pepsin appeared better than trypsin as a rHBsAg-digestion protease. It appeared that epitope-containing peptide fragment was bound to rHBsAg, as analyzed by SPR biosensor. Identification and characterization of the fragment(s) is in progress. There is a epitopic peptide fragment among peptide fragments from digested rHBsAg using SPR biosensor.