하지 허혈양상화가 흰쥐의 콩팥에서 SOD와 iNOS의 발현에 미치는 영향

Abstract

허혈양상화(ischemic preconditioning)는 허혈 전에 짧은 허혈(ischemia)과 재관류(reperfusion)를 반복하는 과정으로, 긴 허혈에 대한 손상으로부터 조직을 보호하는 현상이다. 그리고 한 장기에서 시도한 허혈양상화는 멀리 떨어진 다른 장기의 허혈과 재관류에 의한 손상으로부터 보호할 수 있다. 이러한 허혈양상화의 효과는 초기 허혈자극 후 발생하여 2시간에서 3시간에 나타나는 초기단계와 12시간에서 24시간에 다시 나타나서 72시간까지 유지되는 후기단계로 나눌 수 있다. 허혈 후 재관류 과정에서 발생되는 활성산소종(reactive oxygen species)은 세포에 산화적 손상을 유도하지만, 세포는 산화자극에 대해 방어할 수 있는 내인성 항산화효소인 superoxide dismutase (SOD)를 가지고 있어, 재관류 시 증가하는 활성산소종을 제거할 수 있다. SOD는 세포질에 존재하는 CuZnSOD와 사립체에 존재하는 MnSOD가 알려져 있다. 또한, 허혈과 재관류는 inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 발현과 활성을 증가시킨다. 그리고, iNOS의 활성으로 생성되는 산화질소(nitric oxide; NO)는 세포에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구자는 흰쥐의 하지에서 짧은 허혈과 재관류를 실행하였을 때, 콩팥에서 SOD와 iNOS의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 다음과 같은 실험을 실시하였다. 허혈양상화는 35주령된 수컷 흰쥐의 왼온엉덩동맥(left commom iliac artery)에서 5분 동안 허혈 시키고 5분 동안 재관류 시키는 과정을 3회와 6회, 10회 반복하는 방법으로 실행하였다. 각 횟수에 따라 재관류 경과시간을 0시간, 3시간, 24시간, 72시간으로 세분화하여 콩팥을 적출한 후, 콩팥 손상은 periodic acid-schiff (PAS)염색으로 확인하였고, CuZnSOD, MnSOD, iNOS의 발현양상과 발현 위치는 western blotting과 면역조직화학염색을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. H-E와 PAS 염색 결과, 하지 허혈양상화를 반복한 후 콩팥에서 사구체와 세관세포의 손상은 재관류 72시간의 실험군에서 가장 심각하였고, 허혈양상화의 반복 횟수에 따른 손상은 3회를 실행한 실험군에 가장 경미하였으나, 10회를 실행한 실험군에서는 가장 심각하였다. 2. CuZnSOD와 MnSOD의 발현은 하지 허혈양상화를 3회와 6회 반복한 후, 72시간 동안 재관류 시킨 실험군의 콩팥에서 정상대조군보다 낮게 발현되었으나, 허혈양상화를 10회 반복한 후, 72시간 동안 재관류 시킨 실험군의 콩팥에서는 정상대조군보다 높게 발현되었다. 3. iNOS의 발현은 하지 허혈양상화를 3회 반복한 후, 72시간 동안 재관류 시킨 실험군의 콩팥에서 정상대조군보다 낮게 발현되었으나, 허혈양상화를 10회 반복한 후, 72시간 동안 재관류 시킨 실험군의 콩팥에서는 정상대조군과 차이가 없었다. 본 실험결과를 종합해볼 때, 흰쥐의 왼온엉덩동맥에서 실시한 반복적인 하지 허혈양상화 처치는 콩팥에서 SOD와 iNOS의 발현을 증가시켰으며, SOD는 콩팥을 보호하고, iNOS는 손상시키는 데 관련되는 것으로 생각된다.; Ischemic-preconditioning is a process by which brief peroids of ischemia and reperfusion induce a state of protection against a sustained ischemic insult. Ischemic-preconditioning of one organ protects other organs from ischemia-reperfusion injury. Ischemic-preconditioning is a biphasic phenomenon; a early phase within minutes, until 2 to 3 hours, a late (or delayed) phase within 12 to 24 hours, until 72 hours. Reactive oxygen species produced during reperfusion, trigger oxidative injury in the cell. Ischemia and reperfusion also induce the intrinsic antioxidant enzyme, superoxide dismutase (SOD), scavenging the reactive oxygen radicals. CuZnSOD and MnSOD is expressed in the cytosol and mitochondria, respectively. Ischemia and reperfusion also increases the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and the iNOS activities. The nitric oxide (NO) derived from iNOS activation is injurious to the cell. The purpose of this study was to investigate early and delayed expression of CuZnSOD, MnSOD and iNOS proteins in rat kidney following episodes of hind-limb ischemic-preconditioning. Thirty five week-old rats were subjected to 3, 6 and 10 cycles of ischemic-preconditioning that was 5 min short ischemia and 5 min repersution at the left common iliac artery. The kidney was removed 0, 3, 24 and 72 hours of reperfusion after ischemic-preconditioning. The ischemic injury was examined by periodic acid-schiff staining. The expression of CuZnSOD, MnSOD and iNOS proteins were assayed by immunohistochemical staining and Western blot analysis. The results obtains from these experiments were as follows: 1. Histologically, the most severe injury of glomerulus and tubules in rat kidney were observed at 72 hours of reperfusion after hind-limb ischemic-preconditioning. The renal injury was mild at 72 hours of reperfusion after 3 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning, but was severe after 10 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning. 2. The expression of renal CuZnSOD and MnSOD proteins decreased at 72 hours of reperfusion after 3 and 6 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning, but was increased at 72 hours of reperfusion after 10 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning, compared to control rat. 3. The expression of renal iNOS proteins was decreased at 72 hours of reperfusion after 3 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning, but showed no change at 72 hours of reperfusion after 10 cycles of hind-limb ischemic-preconditioning, compared to control rat. In conclusion, these results suggest that hind-limb ischemic-preconditioning increases both SOD and iNOS in the rat kidney, and these are related with protect and injury, respectively.