인공 조직 지지체 개발을 위한 성장인자와 말토즈 결합 단백질의 융합단백질 개발 및 특성 분석

Abstract

Extracellular matrices (ECM)는 세포의 증식, 분화, 이동, 사멸 등 세포의 기능 조절에 중요한 역할을 한다. 세포 외 환경 (niche)에서 세포 내 시그널의 조절을 위해 ECM을 인공적으로 만든 artificial ECM (art-ECM) 의 개발은 조직공학과 세포 생물학 분야에서 많은 관심을 받아왔다. 이러한 art-ECM을 개발하기 위한 기존에 사용되는 방법들이 가진 고정화된 성장인자가 생물학적 활성을 잃어버린다는 단점을 개선하기 위해 본 연구에서는 혈관 성장인자(VEGF)와 표면에 소수성 도메인을 갖는 maltose binding protein(MBP)을 재조합 링커(linker)로 이용한 새로운 art-ECM인 MBP-VEGF를 개발하였다. MBP-VEGF의 polystyrene (PS)표면에서의 흡착여부를 알아보기 위해 biotin-streptavidin detection system과 Quartz-Crystal Microbalance (QCM)을 이용하여 확인하였다. 이 결과를 토대로 MBP-VEGF의 농도가 증가 할수록 흡착양의 증가를 확인 함과 동시에MBP 의 소수성 도메인을 이용해 소수성 표면에 흡착됨을 증명하였다. MBP-VEGF의 VEGF활성을 조사하기 위해 VEGF 수용체 과발현 세포인 HEK293/KDR 세포를 수용성 MBP-VEGF와 VEGF로 자극시켜 VEGFR의 인산화 시그널을 western blot (W/B)으로 비교 분석하였다. PS표면에 고정화된 MBP-VEGF의 생물학적 활성을 조사하기 위해 W/B과 세포 흡착, 세포형태를 조사해본 결과 MBP-VEGF 고정화 표면에서의 세포의 흡착이 VEGF 수용체와 VEGF간의 상호작용에 의해 일어남을 증명 하였다. 또한 이 결과로 우리는 MBP-VEGF 고정화 표면과 수용성 상태의 MBP-VEGF 가 세포에 미치는 영향이 다름을 예상 할 수 있었다. 본 연구팀에서 개발 한 MBP-VEGF 는 VEGF 수용체와 VEGF간의 상호작용을 이용하여 세포의 흡착 및 기능을 조절 할 수 있는 art-ECM임을 확인 하였다. 우리는 이 MBP 고정화 시스템을 이용하여 다양한 단백질을 소수성 표면에 고정화 시키는 도구로써 활용할 예정이다.; The designs of artificial extracellular matrices (art-ECM) have attracted much attention in tissue engineering and in cell biology research. This research is focused on the characterization and biological activity of synthesized novel art-ECM. We hypothesized that the maltose-binding protein (MBP), which has a large number of exposed hydrophobic zones, might be used as a link for the immobilization of growth factors (GFs). A new fusion MBP-vascular endothelial growth factor (VEGF) was synthesized as an art-ECM. To check whether MBP acts as a linker to immobilize VEGF to polystyrene (PS) surface, MBP-VEGFs immobilization efficiency for PS surface was investigated by using a biotin-streptavidin detection system with biotin-conjugated MBP-VEGFs and by a quartz crystal microbalance (QCM) analysis. The amount of immobilized MBP and MBP-VEGFs dose-dependently with the amount of the proteins added. Further, HEK293/KDR cells were stimulated with soluble MBP-VEGFs and compared to stimulation with VEGFs or MBP alone. We found the phosphorylation of VEGF receptors in the MBP-VEGF stimulated cells from Western blot analysis. Cell adhesion to a MBP-VEGF immobilized surface was mediated by the VEGF-VEGFR interaction. These results indicate that MBP-VEGFs are active and that cells will adhere and respond differently to an MBP-VEGF-immobilized surface as compared to in a soluble environment. Also, we found that the cell morphology of HEK293/KDR cells cultured on MBP-VEGF-immobilized surface was different from those cultured on un-immobilized surface. A MBP-VEGF will utilize an art-ECM to induce cell adhesion or cell signaling through VEGF-VEGFR recognition system. Furthermore, MBP immobilization system will provide an interesting tool to anchor various bioactive proteins to hydrophobic surface.