다단계 배양방법에 의한 생후 5일령 ICR생쥐 정원줄기세포의 전분화능 리프로그램밍

Abstract

정자형성과정 (spermatogenesis)은 생쥐를 포함한 대부분의 포유류에서 유전학적으로 또는 생식학적으로도 매우 중요한 현상이다. 정원줄기세포 (spermatogonial stem cell, SSC)는 이러한 과정에서 중추적인 역할을 맡고 있으며, 자가증식을 통해 일정한 줄기세포 수를 유지하거나, 2회의 연속된 감수분열을 수반하는 정모세포발생과정 (spermatocytogenesis) 그리고 기능성 정자로 만들어주는 정자변태과정 (spermiogenesis)에 이르는 분화 과정를 통해 다수의 반수체 생식세포 즉, 정자 (spermatozoa)를 만들어 낸다. 최근 정원줄기세포를 오랜 기간동안 체외 배양하거나 또는 이로부터 유래한 다분화능 정원줄기세포가 보고되었지만, 제한된 배양조건들을 비롯하여 다분화능 세포의 리프로그래밍 현상에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 연구의 제 1 장에서는 기존에 배양이 가능하다고 보고된 생쥐 종이 아닌 유전적으로 변형되지 않은 out-bred ICR 종의 정소 내 존재하는 정원줄기세포를 체외 배양 및 체외 분화한 후 그 세포의 특성을 알아보고자 하였다. GS 배양액과 내재성 정소 세포들을 이용하는 1 단계 배양방법과 동 배양액과 외인성 MEF 세포들을 이용하는 2 단계 배양방법을 통해 생후 5 일령 out-bred ICR 생쥐의 정원줄기세포를 성공적으로 체외배양하고, RT-PCR과 면역세포화학법, 그리고 telomerase 활성을 분석하여 정원줄기세포임을 확인하였다. 또한, 장기간 체외 배양/유지되고 있는 이들 세포를 BST 배양액을 이용한 체외분화실험을 통해 분화를 유도하면 정모세포 (spermatocyte) 그리고 정세포 (spermatid)의 특이적 표지인자의 발현이 나타나게 되는데, 이는 정원줄기세포의 고유한 단분화능 (unipotency)이 지속적으로 유지되고 있음을 입증하여 준다. 제 2 장에서는 단분화능 정원줄기세포가 다단계 배양시스템을 이용한 역분화 (dedifferentiation) 즉, 배양-유도 리프로그램 (culture-induced reprogramming)에 의해 다분화능 상태의 정원줄기세포 (multipotent SSC)로 전환될 수 있음을 보여주었다. 다분화능을 획득하는 리프로그램 과정은 단분화능에서 다분화능 특이적 표지인자들이 발현하기 시작하는 중간단계의 정원줄기세포 (intermediate state SSC)를 거쳐 다분화능으로 진행된다. 다분화능 정원줄기세포의 특성을 RT-PCR, 면역세포화학법, FACS, DNA methylation, miRNA와 realtime-PCR, 체외분화방법, 기형종 형성, 그리고 chimera 생산을 통해 분석하였고, 다분화능 정원줄기세포는 생쥐의 배아줄기세포 (ESC)와 유사한 체외 그리고 체내 다분화능을 지니게 됨을 확인하였다. 단분화능 정원줄기세포는 남성불임치료에 유용할 수 있으며, 배양-유도 리프로그램을 통해 얻어진 다분화능 정원줄기세포는 자가세포치료법에 중요한 자원이 될 수 있다. 또한 중간단계의 정원줄기세포 연구를 통해, 세포 리프로그램 현상과 성체줄기세포들에 관련된 연구에 큰 도움을 줄 것으로 사료된다.