High Performance Liquid Chromatography를 이용한 human plasma에서의 valproic acid의 분석방법개발과 생체이용률시험

Abstract

Valproic acid의 가장 중요한 적응증은 전신발작중의 하나인 결신발작에 대한 치료이다. Valproic acid는 신경세포의 지속적인 고빈도 반복흥분을 차단하여 항경련작용을 나타낸다. 간염 또는 중증의 감염, 본 제제 과민증자, 중증의 간장애, 카바페넴계 항생물질 투여자, 포르피린증 등은 금기사항이며, 임산부, 췌장장애, 골수손상 기왕력자, 간장애 또는 그 기왕력자, 약물 과민증자, 신부전, 혈액응고장애 등에서는 신중하게 투여하여야 한다. Valproic acid의 유해작용으로는 오심, 구토, 복통, 가슴 쓰림 등과 같은 위장관 증상과 간독성, 혈소판 감소증 등이 있다. Valproic acid 정을 대상약으로 생물학적동등성시험을 수행하기 위한 혈장시료처리방법, 및 High-performance liquid chromatography (HPLC) 분석방법을 확립하였고, 생물학적동등성시험 기준 (식약청고시 제2002-60호, 2002.11.22)에 따라서 건강한 성인 9명을 선정하여 sodium valproate (200 ㎎, 삼진제약 <에필람정>)를 1회 경구 투여하고 24시간 채혈하여, 혈장 내 valproic acid 농도를 정량한 후, sodium valproate (200 mg)정의 AUC, Cmax, tmax, Ke, 및 t1/2β 등 약동학적 지표들을 다음과 같이 산출하였다. 1. ODC-역상 HPLC column (5um, 4.6mm×150mm)을 사용하는 단상-역상 HPLC 방법으로 혈장 sodium valproate 농도를 정량분석하는 혈장시료처리방법 및 HPLC 분석조건들을 확립하였다. 혈장 시료의 처리를 위하여 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 -70℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 진탕한 다음 혈장 400 ㎕를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부표준물질(internal standard : IS)인 nonanoic acid용액(0.1 ㎎/㎖ in acetonitrile) 100 ㎕를 혼합한 후, acetonitrile 400 ㎕와 10% ZnSO4 50 ㎕를 가하여 혼합하고 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액 750 ㎕를 취한다. Valproic acid의 p-bromophenacyl bromide 유도체 합성 : 2% p-bromophenacyl bromide와 0.05% dicyclohexane-18-crown-6가 되도록 acetonitrile에 녹인 후 200 ㎕를 750 ㎕의 상층액에 가하고 70℃의 thermal block에서 15분간 반응시킨 다음 hexane 600 ㎕를 넣어 혼합한다. 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액 450 ㎕를 다른 tube에 옮겨 놓는다. 남은 하층액에 다시한번 hexane 450 ㎕를 가하여 혼합하고 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리, 상층액 450 ㎕를 이미 옮겨놓은 상층액 450 ㎕에 혼합한 후 총 900 ㎕를 50℃의 thermal block에서 질소 기류하에 건조한 후 이동상 250 ㎕로 녹인다. 이를 micro-nylon syringe filter (pore size : 0.2 ㎛)로 여과한 후 시료용액 50 ㎕를 HPLC-injector에 주사하여 HPLC상에서 분리-정량하였다. 분석기기 조건은, 펌프는 Waters 515 pump을, 검출기로는WatersTM 486 Tunable Abosorbance Detector (254 nm)를, 컬럼은 CAPCELL PAK C18 Column (5㎛, 4.6㎜ I. D × 50㎜)를, 데이터 처리장치로는 ds CHROM data module의 Integrator를 사용하였다. 이동상으로는 acetonitrile : MeOH : DW = 65 : 10 : 25 (v/v)혼합용액을 사용하고 유속 1.0 ㎖/min에서 정량 하였다. Column의 온도는 35℃ 로 설정하였다. 2. 검출한계는 0.5 ug/ml 이며 0.5 ug/ml - 100 ug/ml 범위에서 양호한 직선성 (r2=1)을 나타내었다. 3. Sodium valproate(200 mg 정, 삼진제약 <에필람정>)의 각 약동학적 지표들은 AUC: 326.25 ug/ml&#12539; hr, Cmax: 18.08 ug/ml, tmax: 4.67 hr, Ke: 0.048 hr- 및 t1/2β: 14.87 hr 등으로 산출되었다.