내분비계교란물질에 노출된 쥐의 Sertoli 세포를 이용한 miRNA 발현이 정자형성에 미치는 영향에 대한 연구

Abstract

전세계적으로 산업화가 이루어지고 많은 경제발전이 이루어지면서 인간들의 삶의 질이 윤택해졌다. 하지만 산업화가 이루어 지면서 삶의 질을 높이기 위하여 생산되는 많은 제품들로 인하여 인간은 많은 환경독성물질에 노출이 되고 있다. 그 중 최근 많이 대두되고 있는 것이 바로 환경호르몬이라 불리는 내분비계교란물질이다. 내분비계교란물질은 대표적인 환경독성물질이다. 내분비계교란물질의 위험성은 1900년대 초반부터 많은 학자들에 의하여 제기되어왔다. 하지만 여전히 우리가 많이 사용하는 플라스틱 등의 많은 제품들을 만들 때 사용되고 있다. 기존의 많은 연구에서 보면 소량의 내분비계교란물질에 노출되어도 그 피해는 노출된 양에 비해 매우 크게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 보았을 때, 내분비계교란물질에 노출이 되면 기존에 알려진 대로 내분비계교란물질이 인체 내에서 직접적으로 생체호르몬을 대신하여 생식과 관련된 메커니즘을 방해할 뿐만 아니라, 다른 메커니즘이 추가적으로 작용을 하여 피해를 증가시킬 것으로 생각하였다. 많은 간접적인 메커니즘 중에서 우리는 인체내의 자가방어기작중 하나인 miRNA가 내분비계교란물질에 노출이 되었을 때 유전자발현패턴을 조절하여 생식과 관련된 메커니즘에 영향을 미칠 것이라 생각하였다. 또한 사전 실험의 결과에서 내분비계교란물질 중 하나인 BPA에 노출되었을 때 miRNA의 발현패턴은 metabolism과 관련된 유전자들은 up-regulation, 그리고 생식에 관련된 유전자들은 down-regulation이 되도록 miRNA의 발현패턴이 변함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 대표적인 내분비계교란물질인 BPA와 NP에 각각 노출된 mouse Sertoli cell인 TM4 cell line에서 공통적으로 조절이 되는 miRNAs를 Agilent mouse miRNA v13을 이용하여 확인한 후, Aglient mouse genome 4 Ⅹ 44 K array를 이용하여 유전자발현패턴 변화를 확인하였다. 그 후, miRNAs의 발현패턴결과와 유전자발현패턴 결과를 비교하여 miRNAs에 의하여 발현패턴의 변화를 보일 것이라 생각되는 유전자들을 확인하였다. 그리고 실제로 miRNAs에 의하여 유전자발현패턴이 변화한 건지를 확인하기 위하여 PNA기반의 miRNA inhibitor를 사용하여 miRNAs를 저해하였을 때 유전자발현의 recovery를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 3시간대에서 공통적으로 발현레벨이 변하는 12개의 miRNA, 24시간대에서 28개의 miRNA를 확인하였고, Gene의 경우 3시간대에서는 160개, 24시간대에서는 857개를 확인할 수 있었다. 그 후, 각각의 miRNA들이 조절할 것이라 생각되는 유전자들을 classification 하였다. 각 시간대별로 up-regulation된 miRNA을 선정하였고, 그 중 정자형성과 관련이 되어 있을 것이라 예상되는 miRNA를 시간대 별로 2개씩 선택하여 miRNA 저해실험을 진행하였다. 3시간대에서는 mmu-miR-148a와 mmu-miR-466g, 24시간대에서는 mmu-miR-421과 mmu-miR-680을 선정하였고, miRNA inhibitor를 이용한 결과 모두 knock down되었음을 확인할 수 있었다. 그 후, 선정된 miRNA가 조절할 것이라 생각되는 정자형성에 관련된 유전자들을 선정하였다. mmu-miR-148a는 S100a11과 Nuf2, mmu-miR-466g는 Sfrs9과 Ncapd2, mmu-miR-421은 Ccne1과 Ar 마지막으로 mmu-miR-680은 Sfrs2와 Ar을 선정하였다. 그후, miRNA에 의하여 down-regulation되었을 것이라 생각되는 정자형성과 관련된 유전자들의 발현레벨의 recovery를 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과, Nuf2와 Sfrs2는 두 약물에서 공통적으로 recovery를 확인할 수 있었다. 하지만 Ccne1은 BPA에서만, Ncapd2와 S100a11은 NP에서만 recovery를 확인할 수 있었다. 이 결과들로 보아, 약물에 노출되었을 때, 약물들이 성호르몬으로서의 직접적인 메커니즘에 의하여 정자형성을 저해할 뿐만 아니라, 외부물질로 인식되어 약물을 분해하기 위하여 자가방어기작인 miRNA를 조절할 때 side effect로 정자형성이 저해되는 것이라 생각할 수 있었다. 본 연구의 결과는, 향후 환경독성물질에 의한 영향을 연구하는데, 기존의직접적인 영향만을 연구하는 것이 아니라, 보다 넓은 접근방식으로 약물에 의한 피해를 규명하고 대처하는데 많은 도움을 줄 것이라 생각된다.