Inhibition studies of Bacillus anthracis Lethal Factor by synthetic compounds and ssDNA aptamers

Abstract

Anthrax is caused by Bacillus anthracis, a bacterium that is able to secret the anthrax toxin. Anthrax toxin is composed of three components, including protective antigen (PA), Edema factor (EF) and lethal factor (LF). Among these toxins, LF, a Zn2+ dependent metalloprotease, is a key virulence component of anthrax toxin. Due to the high level of secretion from the bacteria and its severe virulence, these toxins have been targeted for both diagnostics and as well as for effective therapeutics. Inhibitors of LF are currently being sought as effective therapeutics for the treatment of anthrax because of its major role in cytotoxicity of target cells. In this study, various novel screening methods were developed and applied to identify synthetic compounds and ssDNA aptamers as LF inhibitors. First, a reverse yeast two-hybrid system in which expression of reporter genes from a Gal4 promoter is repressed by anthrax LF proteolytic activity was developed in a high-throughput format. Yeast cells were co-transformed with LF and a chimeric transcription factor that contains a LF substrate sequence inserted between the DNA-binding and activation domains of Gal4. In the resulting yeast cells, LF cleaves the substrate, thus inactivating the chimeric Gal4 and resulting in lack of expression of reporter genes. Compounds that inhibit LF cleavage of its substrate are identified by changes in reporter gene activity. Relative to in vitro screens for inhibitors of LF proteolytic activity, this screen has the advantage of excluding compounds that are toxic or non-permeable to eukaryotic cells. Additionally, the screen has the advantage of being fast, easy and cheap because exogenous lethal factor and substrate are not needed. The system has identified four candidate inhibitors which were found to inhibit LF protease activity in an in vitro assay. Furthermore, FBS-00831, one of the compounds identified shown to protect Raw 264.7 macrophages from anthrax lethal toxin. FBS-00831 was modeled onto the structure of LF using molecular docking, which led to the hypothesis that the inhibitor binds outside the catalytic site, which would represent a novel binding interaction for an LF inhibitor. Second, a proteolytic assay-based screening method was also developed to identify novel LF inhibitors from a naturally extracted chemical library. The screening identified four compounds that inhibited in vitro proteolytic activity of LF with an IC50 of low micromolar range (11 – 20 µ M) IC50 값을 가지는 4 종의 in vitro LF 저해제를 확인하였다. 이중에서 3 종의 화합물은 Raw 264.7 세포주에 대하여 독성을 나타내어 세포 수준 테스트는 더 이상 진행을 할 수 없었다. 화합물 No.200 은 세포독성 테스트결과 세포에 대하여 독성이 낮으며 효과적으로 세포 내에서 LF의 활성을 저해하여 Raw 264.7 세포의 생장을 회복시키는 것으로 확인 하였다. 세포 수준 테스트에서 화합물 No.200 은 39.2 µ M). Three of these compounds were toxic to the mouse macrophage-like cell line, RAW 264.7. Compound 200 was non-toxic, however, and successfully protected Raw 264.7 cells from a lethal toxin challenge with an IC50 of 39.2 μM. Furthermore, possible binding modes of compound 200 also identified by molecular docking. Third, a systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) was employed to screen for novel aptamers against LF. As a result, three aptamers were found, of which binding affinity were determined by fluorimetry using the fluorophore Cy3 attached to the aptamers. One of the aptamers exhibits high affinity with a Kd value of 11.0 ± 2.7 nM along with specificity relative to bovine serum albumin. Furthermore, LF was successfully detected by an aptamer- based ELISA method. The dual function possibilities (i.e, detection and therapeutics) of the apatamer were also examined by assessment of the inhibition of LF protease activity against a mitogen-activated protein kinase kinase (MAPKK). The aptamer appears to be an effective inhibitor of LF with an IC50 value of 15 ± 1.5 µ M. Thus, this aptamer provides a clue for development of both a sensitive diagnostic device of B. anthracis infection and the design of novel inhibitors of LF. In summary, the identified novel candidate synthetic compounds and ssDNA aptamers against LF inhibition are believed to be useful for development of novel LF therapeutic agents. |탄저는 Baillus anthracis 세균에 의해 야기되는 질병으로서 이 세균은 탄저 독소로 알려진 LF(Lethal Factor), EF(Edema Factor), 및 PA(Protective Antigen)을 생산하고 분비할 수 있는 능력을 가진다. 이 세가지 독소들 중에서 LF는 Zn2+ 의존적 단백질 가수분해효소로서 탄저 독소 구성 중에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 탄저 독소의 고농도의 분비 및 급성 병원성 때문에 세균 감염 진단 및 효율적인 독성 중화를 위하여 탄저 독소들은 저해 목표물 및 진단의 지표로 사용되었다. 특히 LF의 저해는 현재 효율적인 탄저의 치료법으로 관심을 받고 있는데 그 이유는 LF가 숙주세포의 독성을 나타내는데 중요한 역할을 하기 때문이다. 본 연구에서는 다양한 스크리닝 방법을 이용하여 LF 저해제로서 합성 화합물 및 ssDNA 압타머 라이브러리를 발굴 하였다. 첫째, reverse yeast two-hybrid 시스템을 이용하여 LF 저해제 스크리닝을 시도 하였다. 이 시스템은 Gal4 유전자로부터 LF 유전자가 발현되어 단백질 가수분해 활성이 나타남으로써 리포터 유전자의 발현이 저해되는 현상을 이용한 것이다. LF 및 LF의 기질 단백질 유전자 서열을 포함하는 chimeric 전사 인자를 yeast에 같이 transformation 하여 유전자 발현을 관찰 하였다. Chimeric 전사인자 유전자 사이에 LF 의 기질 단백질 유전자를 삽입 함으로써, 차후 기질 단백질의 절단으로 인한 Gal4 단백질의 활성을 관찰 하는데 이용하였다. 그 결과, LF 및 Gal4 유전자가 발현되면 yeast 세포 내에서 LF의 활성에 의하여 Gal4 단백질 사이에 존재하는 LF의 기질 단백질이 가수분해 되고 결국 리포터 유전자는 발현이 억제된다. 이때 LF의 저해제를 처리해주면 리포터 유전자는 정상적으로 발현하게 된다. 이러한 기전을 이용하여 LF의 저해제 발굴에 사용하였다. 이 시스템은 in vitro 스크리닝에 비하여 세포에 독성이 있는 화합물을 구분 할 수 있는 장점이 있다. 또한 스크리닝을 위하여 필요한 LF와 기질 단백질이 별도로 필요하지 않기 때문에 신속, 간편, 및 저 비용의 스크리닝이 가능하다. 이 시스템을 이용하여 4가지의 합성 화합물을 스크리닝 하였고 그 중에서 FBS-08831 화합물은 세포 수준의 테스트에서도 활성이 있는 것으로 나타났다. 그리고 modeling 연구를 통하여 이 저해제가 LF의 촉매영역에 결합하는지 여부를 확인하였다. 두 번째, SDS-PAGE 를 이용하여 단백질 가수분해 효소의 활성검정을 통하여 천연물 추출 화합물을 사용하여 LF 저해제를 스크리닝 하였다. 천연물 추출 화합물은 자연에서 추출하였기 때문에 상대적으로 낮은 세포 독성을 가지는 것을 알려져 있어 최근 약물 개발에 이용되어 왔다. 천연물 라이브러리에서 낮은 micro molar 범위의(11-20 µ M 의 IC50 값을 나타내었으며 이것은 이미 알려진 탄저 독소 치료제인 GM6001 화합물의 34.8 µ M 의 IC50 값과 비교하였을 때 거의 비슷한 수준의 저해 능력을 나타내는 것을 확인 하였다. 세 번째는 systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 방법을 이용하여 기존에 많이 연구되고있는 합성 화합물이 아닌 ssDNA 압타머를 이용하여 새로운 LF 저해제를 스크리닝 하였다. 결과적으로 3개의 특정 서열을 가지는 압타머를 선별 하였으며, 형광물질인 Cy3 를 연결한 압타머를 이용하여 LF에 대한 결합력을 측정 하였다. 압타머 ML 12 는 BSA 에 대한 특이성뿐만 아니라 11.0 ± 2.7 nM Kd 값의 낮은 결합력을 나타내었다. 그리고 이 압타머는 IC50 value of 15 ± 1.5 µ M 의 값을 가지며 효과적으로 기질 가수분해를 저해 하는 것을 확인 하였다. 이러한 압타머는 LF의 진단뿐만 아니라 LF 활성저해도 동시에 할 수 있기 때문에 양 기능성 압타머로서 작용 할 수 있다. 결론적으로, 합성 화합물 및 ssDNA 라이브러리에서 reverse-two hybrid system 및 SELEX 방법을 이용하여 신규 구조 및 서열을 가지는 LF의 저해제를 스크리닝하였다. 이러한 다양한 라이브러리에서의 LF 저해제 스크리닝은 다수의 새로운 구조 및 서열을 가지는 LF 저해제를 확인할 수 있는 결과를 보여 주었다. 이러한 신규 LF 저해제들은 차후 LF 뿐만 아니라 탄저의 치료제 개발에 매우 유용하게 이용될 것으로 사료된다.; M. Thus, this aptamer provides a clue for development of both a sensitive diagnostic device of B. anthracis infection and the design of novel inhibitors of LF. In summary, the identified novel candidate synthetic compounds and ssDNA aptamers against LF inhibition are believed to be useful for development of novel LF therapeutic agents.