Sarpogrelate는 간성상세포의 활성화를 억제하여 간의 섬유화를 억제한다

Abstract

배경 및 목적: 5-HT 수용체는 5-HT1부터 5-HT7까지 아형이 알려져 있고 인간의 신체에 다양하게 분포하며 감정과 식욕, 수면의 조절과 위장관 운동/분비, 혈관수축/이완, 혈소판 응집 등 다양한 역할을 한다. 5-HT가 간세포 증식과 사멸에 연관이 있다는 여러 연구들이 보고되고, 5-HT 가 다른 인체 조직의 섬유화에 밀접한 연관이 있다는 것이 밝혀지고 있어 간경화에도 5-HT를 통한 기전이 관련되어 있을 가능성을 유추할 수 있다. 저자들은 혈소판에서 분비되는 5-HT가 간세포의 증식과 사멸에 중요한 역할을 한다고 가정하고, 말초에 선택적으로 작용하는 5-HT2 수용체 길항제가 어떠한 기전을 통하여 간성상세포의 사멸과 분화에 영향을 미치는지와 실제 생체 내에서 간 내 섬유화에 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 불멸화 인간 간성상세포 (LX-2 세포)를 배양하여 실험에 사용하였으며, 다양한 농도의 5-HT2A 수용체 길항제인 sarpogrelate를 투여하였다. 이후 세포의 이동 (migration)과 증식 (proliferation), 활성산소 (reactive oxygen species)의 생성을 광밀도측정 (optical density measurement)으로 검사하였고, 효소면역분석 (Enzyme immunoassay; EIA)으로 procollagen type I의 양을 측정하였으며, α-SMA, TGF-β 와 Smads 등은 Western blot을 사용하여 측정하였다. 간섬유화의 정도는 METAVIR scoring system을 이용하여 수치화하였다. 결과: 세포의 증식을 관찰하기 위한MTT assay에서 100µM sarpogrelate 투여군이 대조군과 비교하여 생존능 (viability)이 24시간 후 (33.5± 2.4%, p<0.05)와 48시간 후 (13.9± 3.8%, p<0.05)에 감소되어 있어 유의하게 증식이 감소되었다. 세포자멸사 관찰을 위한TUNEL assay에서24시간 후 sarpogrelate 50 µM 투여군에서 자멸사 세포비율이 대조군에 비해 의미있는 증가를 보였고, (12.34%, p<0.05) 48시간 후에는 5 µM 투여군과 50 µM 투여군에서 대조군에 비해 자멸사가 의미있게 증가하였다. (9.4%와 12.1%, p<0.05) LX-2세포 내에서 α-SMA의 발현은 sarpogrelate를 10 µM과 50 µM 투여하였을 때 대조군과 비교하여 현저하게 감소하였다. (58.1±4.1% and 41.9±5.2%, p<0.05) Procollagen type I의 발현도 sarpogrelate 투여군이 대조군에 비하여 현저히 감소하였다. (대조군: 25.3±3.2 (arbitrary unit), sarpogrelate 1 µM: 16.0±2.9, sarpogrelate 5 µM: 15.5±4.2, sarpogrelate10 µM: 13.8±2.1, sarpogrelate 50 µM: 10.0±3.7, sarpogrelate 100 µM: 1.2±0.6, p<0.05) LX-2 세포에서 인위적인 상처의 회복을 관찰하였을 때 PDGF를 투여한 군 (33.3±11.7 µm)과 비교하여 sarpogrelate를 투여한 군 에서 통계적으로 유의하게 상처회복을 억제하였다. (366.7±48.5 µm, p<0.05) 생체 내 실험에서는 TGF-β의 발현이 TAA만을 투여한 쥐들에서는 대조군에 비해 증가하였고, (118.2±18.2% %) 4주째부터 sarpogrelate를 추가한 쥐들의 간에서는 대조군에 비해 통계적으로 의미있게 감소하였다. (58.9±0.8, p<0.05) SMAD 2/3은 TAA만을 8주간 투여한 군에서 대조군에 비해 증가하는 양상을 보였고, (대조군의130.4±4.7%/170.1±35.7%) 후반의 4주 간 sarpogrelate 를 투여한 군에서는SMAD 2/3의 발현이 의미 있게 감소하였다. (대조군의 78.1±3.9%/83.4±20.6%, p<0.05) Sarpogrelate를 투여한 쥐의 간에서 조직학적으로 염증과 섬유화의 호전을 관찰할 수 있었지만, 통계적으로 섬유화의 호전은 유의하지 않았다. 결론: 본 연구에서 저자들은 5-HT2A 수용체 길항제인 sarpogrelate가 간성상세포의 증식과 활성화를 억제하여 항섬유화 작용을 한다는 결론을 얻었으며, 실제로 생체 내에서 간 섬유화를 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.

|Background & Aim: 5-HT and fibrosis are closely related, and 5-HT is thought to play very important role in the regeneration and apoptosis of hepatocye. The aim of this study was to determine that 5-HT2A receptor antagonist can prevent hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation. Materials and methods: The immortalized human hepatic stellate cell line (LX-2 cell) was used and various concentration of 5-HT2A receptor antagonist, sarpogrelate was administrated. Cell migration, proliferation and reactive oxygen species (ROS) production was examined by optical density measurement. Total Amount of the procollagen type I was measured by EIA. α-SMA, TGF-β and Smads were measured by Western blot. The histology of rat liver was assessed by the METAVIR scoring system. Results: In vitro model, the viability of LX-2 cells decreased with 100 µM of sarpogrelate. (After 24hrs, 33.5± 2.4%, p<0.05) (After 48hrs, 13.9± 3.8%, p<0.05) The apoptosis of LX-2 cells significantly increased with 50 µM of sarpogrelate. (After 24hrs, 12.34%, p<0.05) (After 48hrs, 12.1%, p<0.05) The expression of α-SMA in LX-2 cells significantly decreased with 10 µM and 50 µM of sarpogrelate. (58.1±4.1% and 41.9±5.2%, p<0.05) The expression of procollagen type I significantly decreased with sarpogrelate. (Control group: 25.3±3.2 (arbitrary unit), sarpogrelate 1 µM: 16.0±2.9, sarpogrelate 5 µM: 15.5±4.2, sarpogrelate 10 µM: 13.8±2.1, sarpogrelate 50 µM: 10.0±3.7, sarpogrelate 100 µM: 1.2±0.6, p<0.05) The wound healing process was significantly suppressed with sarpogrelate (366.7±48.5 µm, p<0.05) compared to the PDGF group (33.3±11.7 µm). In vivo model, the expression of TGF-β increased in TAA group, (118.2±18.2%) and significantly decreased in sarpogrelate group. (58.9±0.8, p<0.05) The expression of SMAD 2/3 increased in TAA group, (130.4±4.7%/170.1±35.7%) and significantly decreased in sarpogrelate group. (78.1±3.9%/83.4±20.6%, p<0.05) Hematoxylin-eosin & Masson’s trichrome stain revealed less inflammation and fibrosis in liver tissue of sarpogrelate-treated rats. Conclusions: The 5-HT2A receptor antagonist, sarpogrelate can prevent hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation.; Background & Aim: 5-HT and fibrosis are closely related, and 5-HT is thought to play very important role in the regeneration and apoptosis of hepatocye. The aim of this study was to determine that 5-HT2A receptor antagonist can prevent hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation. Materials and methods: The immortalized human hepatic stellate cell line (LX-2 cell) was used and various concentration of 5-HT2A receptor antagonist, sarpogrelate was administrated. Cell migration, proliferation and reactive oxygen species (ROS) production was examined by optical density measurement. Total Amount of the procollagen type I was measured by EIA. α-SMA, TGF-β and Smads were measured by Western blot. The histology of rat liver was assessed by the METAVIR scoring system. Results: In vitro model, the viability of LX-2 cells decreased with 100 µM of sarpogrelate. (After 24hrs, 33.5± 2.4%, p<0.05) (After 48hrs, 13.9± 3.8%, p<0.05) The apoptosis of LX-2 cells significantly increased with 50 µM of sarpogrelate. (After 24hrs, 12.34%, p<0.05) (After 48hrs, 12.1%, p<0.05) The expression of α-SMA in LX-2 cells significantly decreased with 10 µM and 50 µM of sarpogrelate. (58.1±4.1% and 41.9±5.2%, p<0.05) The expression of procollagen type I significantly decreased with sarpogrelate. (Control group: 25.3±3.2 (arbitrary unit), sarpogrelate 1 µM: 16.0±2.9, sarpogrelate 5 µM: 15.5±4.2, sarpogrelate 10 µM: 13.8±2.1, sarpogrelate 50 µM: 10.0±3.7, sarpogrelate 100 µM: 1.2±0.6, p<0.05) The wound healing process was significantly suppressed with sarpogrelate (366.7±48.5 µm, p<0.05) compared to the PDGF group (33.3±11.7 µm). In vivo model, the expression of TGF-β increased in TAA group, (118.2±18.2%) and significantly decreased in sarpogrelate group. (58.9±0.8, p<0.05) The expression of SMAD 2/3 increased in TAA group, (130.4±4.7%/170.1±35.7%) and significantly decreased in sarpogrelate group. (78.1±3.9%/83.4±20.6%, p<0.05) Hematoxylin-eosin & Masson’s trichrome stain revealed less inflammation and fibrosis in liver tissue of sarpogrelate-treated rats. Conclusions: The 5-HT2A receptor antagonist, sarpogrelate can prevent hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation.