바이오 물질 검출을 위한 전기화학검출 방식의 biosensor 개발

Abstract

최근 건강에 대한 관심이 증가되면서 질병 의 자가 및 조기 진단 분야가 각광을 받고 있다. 이러한 관심은 생명 과학 분야 및 의료 기술 분야의 연구 활성화로 인해 실제 생활에 활용되고 있다. 현재 생명 분야의 연구는 분자 상호간의 반응성에 주목하여 연구가 진행되고 있다. 이런 분자 상호작용이 크게 DNA 간의 상호작용 DNA와 protein의 상호작용, 마지막으로 protein 간의 상호작용으로 구분할 수 있다. 이러한 분자간의 상호작용을 관찰할 수 있는 방법 및 도구를 개발 할 수 있다면 생명 상호작용에 대한 연구에 도움이 되고 이를 이용한 다양한 연구의 밑바탕이 될 수 있을 것이라 생각된다. 본 연구에서는 이러한 연구 대상에 대한 정확하고 다각적인 분석을 위하여 최근 주목 받고 있는 기술인 검출 원리가 간단하고 반응이 쉬우며 소형화된 진단 장비에 적용할 수 있는 전기 화학적 검출 방법을 이용하여 소형화가 가능하고 간단하면서도 정확한 검출이 가능한 진단 biosensor 개발을 목표로 연구를 진행한다. 본 연구는 기초 실험을 통하여 최적화시킨 조건을 기본으로 하여 이를 검출할 수 있는 biosensor를 개발하여 이를 응용함으로써 최종 목적인 여러 가지 질병의 조기 진단이 가능한 biosensor를 개발한다. 인간 질병에 대한 진단용 biosensor로의 응용이 가능할 것으로 판단 되어 연구를 진행하였다. 최적화한 biosensor를 이용하여 전기 화학적 검출 방법을 응용한 진단용 biosensor를 검증하기 위하여 첫 번째로 DNA-protein 상호작용을 확인하기 위하여 전립선암의 protein biomarker인 PSA를 이용하여 이를 특이적으로 인지하여 결합하는 DNA 분자인 aptamer와의 상호작용을 관찰할 수 있도록 개발한 biosensor를 이용하여 CV 및 EIS 방법으로 전립선 암의 조기 검출을 위한 biosensor 연구를 진행하였다. CV의 경우 0.1 ng/ml – 1 µg/ml 범위에서 안정적인 전기 화학 신호 검출이 가능하였다. 각각의 반응에 대하여 전기 화학 신호 상의 차이를 보이기 때문에 구별이 가능하고 농도 별 구분이 이 범위의 농도 결과 중 특히 0.1 ng/ml – 5 ng/ml의 농도 범위에서는 R2 값은 0.95를 넘는 결과값을 나타냈기 때문에 신뢰도 있는 결과를 통하여 결과를 증명하였다. 또한 EIS 결과도 마찬가지로 0.1 ng/ml – 1 µg/ml 범위에서는 선형성을 나타내는 일정한 결과 값이 나오고, 정확한 농도 감별이 가능한 0.1 ng/ml – 5 ng/ml 범위에서는 R2 값은 0.90을 넘는 결과값을 나타내었다. 이를 통하여 신뢰도가 높은 biosensor 연구가 가능했다. 이 결과 값이 중요한 이유는 PSA에 의한 전립선 암을 진단하는 value가 4 ng/ml이기 때문에 이 값을 안정적으로 진단할 수 있는 범위이기 때문에 반복 실험을 통하여 안정적인 전기 화학 신호를 구현하였다. 두 번째 연구 결과로서 protein-protein 상호작용을 확인하기 위하여 MMPs family 효소의 효소 활성도 의 측정을 통하여 질병을 진단 할 수 있도록 개발한 biosensor를 이용하여 CV와 EIS를 통하여 검증하였다. 이 때 사용한 MMPs family 효소는 MMP-2와 MMP-7으로 각각이 난소암과 대장암의 효과적인 biomarker로 연구가 활발하게 진행되고 있다. Protein-protein 상호작용의 경우 효소 activity를 검출에 응용함으로써 효과적인 연구를 진행 할 수 있다. 본 연구에서 응용한 두 가지 전기 화학적 검출 방법 중 CV의 경우, MMP-2 농도에 따라 차이가 나는 결과값들이 보이는 경향성을 나타냈고, 1 pg/ml – 100 ng/ml 범위에서 안정적인 전기 화학 신호 검출이 가능하였다. 이를 통하여 표준화 분석을 실시하면 0.99의 R2값을 가지는 표준화 곡선을 얻는 결과값을 얻을 수 있었다. MMP-7의 CV의 경우, MMP-7 농도에 따른 결과 값의 차이를 확인할 수 있었으며, 10 pg/ml – 100 ng/ml 범위에서 안정적인 전기 화학 신호 검출이 가능하였다. 이를 통하여 표준화 분석을 실시하면 0.95의 R2값을 가지는 표준화 곡선을 얻는 결과값을 얻을 수 있었다. 다른 검출 방법인 EIS방법을 통한 결과에 대한 분석을 통하여 MMP-2의 경우 1 pg/ml – 100 ng/ml 농도 범위에서 농도 변화에 따른 안정적인 전기 화학 신호 검출이 가능하였다. 이를 토대로 표준화 분석을 통해 분석하면 0.94의 R2값의 표준화 곡선을 얻을 수 있다. MMP-7의 경우도 마찬가지로 농도에 따른 결과 값의 차이를 확인할 수 있었으며, 10 pg/ml – 100 ng/ml 범위에서 안정적인 전기 화학 신호 검출이 가능하였다. 또한 결과값 분석을 통하여 0.97의 R2값의 표준화 곡선을 얻을 수 있다. EIS결과는 CV결과를 다시 한 번 검증하는 한 편 전기 화학적 검출 방법의 다른 방법인 EIS 방법에서도 전기 화학적 반응이 성공적으로 일어 났음을 나타낸다. 이를 토대로 난소암과 대장암에 대한 여러 가지 검증을 거쳐 신뢰도 높은 진단용 biosensor개발을 수행했다. 이는 기존의 검출 방법보다 더욱 민감한 biosensor 개발의 가능성을 확인했다. 결과적으로, 미세 유체 공학 기술과 bioMEMS 기반의 biosensor이 성공적으로 제작되었으며 매우 단순한 구조이기 때문에 제작이 쉽고 대량 생산 또한 가능하다는 이점이 있다. 본 연구에 쓰인 전기 화학적 검출 시스템은 기존 검출 보다 검출 장비의 부피를 축소시킬 수 있으며 융합 연구를 통하여 POCT를 위한 휴대용 검출 기기의 연구 개발에 효율적으로 쓰일 수 있는 기초 기술 개발이 될 수 있을 것으로 생각된다. |Recently people have become more focused on their personal health, placing more attention on self and early diagnostics. Early diagnostics values and the probability of full recovery of a number of human diseases have increased, as researchers have studied new diagnostic methods for human diseases. Self-diagnostics, prior to hospital diagnostics, are an emerging trend, which use integrated biotechnology techniques and new diagnostic machines and methods. Biotechnology is actively studied for molecular interactions. Molecular interactions are divided into several categories, including DNA-DNA interactions, DNA-protein interactions and protein-protein interactions. If we develop methods and tools for the detection of molecular interactions, this should be beneficial towards research for life science and biotechnology, and in practical applications for many researches of molecular interactions. We developed a microbiochip based on impedance biosensor design and fabrication technology. We then conducted comparative analyses with other studies to assess sensitivity, accuracy, selectivity and stability of our biosensor Our research goal is the development of an electrochemical biosensor for the diagnostic of human disease. Electrochemical detection methods are applied for biosensors, because the signal change step is very simple, with high sensitivity, and can be used with a small detection device. Our biosensor has many applications for life science and biotechnology research. We studied aptamer for the detection of DNA-protein interactions. Using CV technology, we detected about 0.1 ng/ml – 100 µg/ml of PSA, and stable electrochemical detection which was concentration dependent. In each reaction, electrochemical signals were different, can distinguish about concentration. In the 0.1 ng/ml – 5 ng/ml range, the value of R2 value was over 0.95, which indicated a sensitive detection for PSA. In EIS experiments, R2 values over 0.90 are considered to be reliable for biosensors for the 0.1 ng/ml – 5 ng/ml range. This value is very important for diagnostics of prostate cancer, as the cut off value of prostate cancer is 4 ng/ml. Our biosensor can detect a stable signal in the diagnostic area. We studied enzyme reactivity for the detection of protein-protein interactions. We detected enzyme reactivity using MMPs family enzyme for diagnostics of human cancer by CV and EIC biosensor technologies. In the case of CV determinations of MMP-2, electrochemical signals are different about concentration of MMP-2 enzyme. The correlation of signal to concentrations appears to have a linear standard curve, with an R2 value of over 0.99. In the case of CV of MMP-7 enzyme, we confirmed a difference of electrochemical signal by MMP-7 concentration. MMp-7 results shows linear standard data for the determined MMP-7 concentration range, the R2 value of which is over 0.95. We detected another electrochemical detection method such as EIS. The R2 value of MMP-2 was over 0.94 and the R2 value of MMP-7 was over 0.97. An EIS technique was used to confirm CV results, and the electrochemical reactions were carried out successfully. Our biosensor is effective in detected electrochemical signals for ovarian cancer and colorectal cancer based on the detections of MMPs family enzymes. Our initial biosensor results encourage the development of more sensitive detection methods. Unlike CV, EIS results may be granted by the meaning of the detection method that can minimize the damage of the sample. As a result, a Bio-MEMS-based biosensor was successfully produced. Analytes were detected within the samples at very low concentrations, and were easily immobilized onto the biosensor. Mass production is critical for the widespread use of bio-MEMS-based biosensors, and is also applicable towards this design due to the very simple structure. Electrochemical detection system can be reduced to the level of the existing detection. If components (e.g. the pump and chamber for sample injection, transport and reaction) are integrated, portable detection devices can efficiently be used in the area of point of care testing (POCT).; Recently people have become more focused on their personal health, placing more attention on self and early diagnostics. Early diagnostics values and the probability of full recovery of a number of human diseases have increased, as researchers have studied new diagnostic methods for human diseases. Self-diagnostics, prior to hospital diagnostics, are an emerging trend, which use integrated biotechnology techniques and new diagnostic machines and methods. Biotechnology is actively studied for molecular interactions. Molecular interactions are divided into several categories, including DNA-DNA interactions, DNA-protein interactions and protein-protein interactions. If we develop methods and tools for the detection of molecular interactions, this should be beneficial towards research for life science and biotechnology, and in practical applications for many researches of molecular interactions. We developed a microbiochip based on impedance biosensor design and fabrication technology. We then conducted comparative analyses with other studies to assess sensitivity, accuracy, selectivity and stability of our biosensor Our research goal is the development of an electrochemical biosensor for the diagnostic of human disease. Electrochemical detection methods are applied for biosensors, because the signal change step is very simple, with high sensitivity, and can be used with a small detection device. Our biosensor has many applications for life science and biotechnology research. We studied aptamer for the detection of DNA-protein interactions. Using CV technology, we detected about 0.1 ng/ml – 100 µg/ml of PSA, and stable electrochemical detection which was concentration dependent. In each reaction, electrochemical signals were different, can distinguish about concentration. In the 0.1 ng/ml – 5 ng/ml range, the value of R2 value was over 0.95, which indicated a sensitive detection for PSA. In EIS experiments, R2 values over 0.90 are considered to be reliable for biosensors for the 0.1 ng/ml – 5 ng/ml range. This value is very important for diagnostics of prostate cancer, as the cut off value of prostate cancer is 4 ng/ml. Our biosensor can detect a stable signal in the diagnostic area. We studied enzyme reactivity for the detection of protein-protein interactions. We detected enzyme reactivity using MMPs family enzyme for diagnostics of human cancer by CV and EIC biosensor technologies. In the case of CV determinations of MMP-2, electrochemical signals are different about concentration of MMP-2 enzyme. The correlation of signal to concentrations appears to have a linear standard curve, with an R2 value of over 0.99. In the case of CV of MMP-7 enzyme, we confirmed a difference of electrochemical signal by MMP-7 concentration. MMp-7 results shows linear standard data for the determined MMP-7 concentration range, the R2 value of which is over 0.95. We detected another electrochemical detection method such as EIS. The R2 value of MMP-2 was over 0.94 and the R2 value of MMP-7 was over 0.97. An EIS technique was used to confirm CV results, and the electrochemical reactions were carried out successfully. Our biosensor is effective in detected electrochemical signals for ovarian cancer and colorectal cancer based on the detections of MMPs family enzymes. Our initial biosensor results encourage the development of more sensitive detection methods. Unlike CV, EIS results may be granted by the meaning of the detection method that can minimize the damage of the sample. As a result, a Bio-MEMS-based biosensor was successfully produced. Analytes were detected within the samples at very low concentrations, and were easily immobilized onto the biosensor. Mass production is critical for the widespread use of bio-MEMS-based biosensors, and is also applicable towards this design due to the very simple structure. Electrochemical detection system can be reduced to the level of the existing detection. If components (e.g. the pump and chamber for sample injection, transport and reaction) are integrated, portable detection devices can efficiently be used in the area of point of care testing (POCT).