표면 증강 라만 분광법의 분석 성능 향상 연구: 장-흐름 분획법과의 연계를 통한 바이오마커 검출 및 나노입자/고분자 복합체를 이용한 측정 재현성 개선

Abstract

본 연구에서는 표면 증강 라만 분광법의 분석 성능을 향상시키기 위한 방안으로 장-흐름 분획법 (Field-flow fractionation, FFF)과의 연계를 통한 바이오마커 검출 연구와 표면 증강 라만 분광법의 측정 재현성 증대를 위한 나노입자/고분자 복합체의 개발 및 응용 연구를 수행하였다.

Part I. 표면 증강 라만 분광법과 장-흐름 분획법의 연계를 통한 바이오마커 검출 극미량의 바이오마커를 선택적으로 검출하기 위하여 시료의 크기에 따라 분리가 가능한 장-흐름 분획법 (Field-flow fractionation, FFF)을 표면 증강 라만 분광법과 연계하여, 시료의 선택적 분리 및 우수한 감도로 동시 분석이 가능한 새로운 분석 시스템을 제안하였다. 제안된 분석 방법을 이용하여 유전자 발현을 조절한다고 알려진 micro-RNA (miRNA)와 탄저병 (Anthrax)의 바이오마커 중 하나인 Protective antigen (PA)의 검출 연구를 수행하였다.

I-1. micro-RNAs (miRNAs) 동시 검출 miRNA 의 초고감도 다중분석 시스템의 개발 및 응용을 목적으로 하였다. 목표 miRNA 의 선택적 인지에 사용할 나노입자-검출 유전자 복합체의 합성을 위하여, 측정하고자 하는 miRNA 에 상보적인 염기서열을 가진 DNA 를 폴리스타이렌 (Polystyrene, PS) 입자 표면에 고정하였고, 이들은 용액 상에서 target miRNA 와 선택적으로 결합한다. 라만 신호를 강하게 발생시킴과 동시에 장-흐름 분획법의 분리 효율을 높이기 위하여 polyadenylation 효소 반응에 의해 poly(A) tail 을 target miRNA 말단에 형성함으로써 Thymine (T)이 붙은 금 나노입자 복합체가 poly(A) tail 에 결합하도록 하였다. 금 나노입자 복합체에는 라만 신호를 발생하는 Raman reporter 를 결합시킴으로써 측정된 신호를 이용하여 장-흐름 분획법에 의해 분리된 시료의 검출이 가능하도록 하였으며, 미량의 miRNA 도 측정이 가능함을 확인하였다. 또한, 다양한 miRNA 의 동시 분석을 위해서 크기가 다른 PS 입자 (5, 10, 15 μm)를 사용하여, 각각의 다른 크기의 PS 입자에 다른 서열을 가지는 세 종류의miRNA를 검출할 수 있도록 고안함으로써 여러 miRNA 의 분리 및 동시 검출이 가능함을 확인하였다.

I-2. 탄저병의 바이오마커 (PA) 검출 PA 의 검출 및 라만 신호 증폭을 위한 나노 구조물로써 금 나노 입자를 이용하고, PA 와 선택적 결합을 위해 진단 대상체 인식용 펩타이드를 이용하였다. 금 나노 입자에 라만 신호 전달 물질 (5,5’- Dithiobis(succinimidyl-2-itrobenzoate, DSNB)을 흡착시킨 후, PA 와 반응하는 서로 다른 아미노산 서열을 가지는 2 종류의 펩타이드를 결합시키도록 하였다. 표면에 결합된 두 종류의 펩타이드는 PA 와 동시에 결합할수있으므로, 나노입자집합체를형성할수있다.형성된나노 입자 집합체는 PA 와 결합하지 않은 SERS probe 나 PA 의 크기보다 상대적으로 커지므로, 장-흐름 분획법에 의하여 분리가 가능하도록 하였고, PA 와 결합된 나노 입자 집합체를 선택적으로 분리함과 동시에 라만 신호를 측정하여 PA 를 검출하였다.

Part II. 나노입자/고분자 복합체를 이용한 표면 증강 라만 분광법의 측정 재현성 향상 표면 증강 라만 분광법의 문제점인 낮은 측정 재현성을 극복하기 위한 방안을 제시하였다. 시료 전체를 대표할 수 있는 측정 방법인 광역 조사 라만 분광법 (Wide area illumination scheme)과 투과 라만 분광법 (Transmission Raman scheme)을 활용하여 표면 증강 라만 분광법의 측정 재현성을 향상시키며, 라만 신호를 얻기 위한 substrate 로 나노입자/고분자 복합체를 이용하였다. 이는 나노입자/고분자 복합체가 다양한 환경에서 물리/화학적으로 안정할 뿐 아니라 고감도 분석 및 우수한 분석 재현성을 가능케 하기 때문이다. 본 연구에서는 하이드로젤과 스펀지를 기반으로 하는 표면 증강 라만 산란 substrate 를 합성하였으며, 이를 이용하여 측정 재현성을 향상하고자 하였다.

II-1. 금 나노 입자/하이드로젤 복합체를 이용한 측정 재현성 향상 연구 실리카가 코팅된 금 나노입자 (Au@SiO2)와 Acrylic acid 를 이용하여 금 나노 입자를 포함하고 있는 Polyacrylic acid 하이드로젤을 합성하였으며, 라만 신호를 측정하기 위하여 금 나노입자 외부의 실리카 코팅을 불산을 이용하여 제거하였다. 이렇게 준비된 substrate 는 하이드로젤의 성질을 이용하여 많은 양의 용액 시료를 흡수할 수 있을 뿐 아니라 물리적으로 안정하다. 또한 금 나노 입자 집합체의 형성을 억제함으로써 substrate 전체로부터 재현성 있는 라만 신호를 얻을 수 있었다. 분석 재현성을 더욱 향상하기 위하여 광역 조사 라만 분광법을 사용하였고, 2-naphthalenethiol 측정 시 정량성 및 분석 재현성이 우수함을 확인하였다.

II-2. 금 나노 입자/스펀지 복합체를 이용한 측정 재현성 향상 연구 쉽고 간편하게 구할 수 있는 스펀지를 이용하여 substrate 를 합성하였으며, 동시에 투과 라만 분광법을 이용하여 분석 재현성을 향상하고자 하였다. 다양한 종류의 스펀지 중에서 금 나노 입자를 스펀지 내부에 강하게 고정시킬 수 있을 뿐 아니라 시료의 흡수가 용이한 멜라민폼 (Melamine foam)을 선택하였다. 멜라민폼은 다공성의 3 차원 구조를 가지고 있어 투과되는 레이저와 시료간 상호작용을 최대화하여 측정 재현성의 향상을 기대하였다. 금 나노 입자를 포함한 멜라민폼을 이용하여 다양한 농도의 4- nitrobenzenethiol 을 측정하여 우수한 정량성을 확인하였으며, 다양한 액체 시료 (De-ionized water, 수돗물, 강물, 오렌지 쥬스)에 포함된 Paraquat (제초제)을 분석하여 현장 적용가능성을 확인하였다.