PI3K 경로 활성을 통한 OGD에 의한 신경줄기세포 사멸에 대한 acetyl-L-carnitine의 신경보호효과

Abstract

뇌졸중은 사망원인 2위이자 단일질환으로는 사망원인 1위에 해당하는 심각한 질병이다. 이러한 stroke의 치료약을 개발하기 위해서 많은 후보물질들이 연구 중이다. Acetyl-L-Carnitine(ALCAR)은 그런 후보물질 중 하나로 원래는 mitochondria 내로 long chain fatty acid를 운반하여 ATP 생성에 도움을 준다. 이러한 ALCAR가 in vivo, in vitro에서의 신경보호효과와 뇌졸중에서의 개선효과를 보인다는 것이 연구를 통해 알려지게 되었다. 그러나 정확한 경로를 확인하는 연구는 진행되지 않았다. 따라서 본 논문에서는 in vitro에서의 ALCAR의 신경보호효과를 검증하고 어떤 경로를 통해서 이루어지는지 확인해보고자 한다. Neural stem cell을 이용하여 실험을 진행하였으며 뇌졸중 환경을 조성하고자 Oxygen Glucose Deprivation (OGD)을 유도하여 환경을 조성하였다. 적합한 환경을 구성하고자 시간별 OGD를 처리한 결과 cell viability가 60% 정도가 되는 8시간으로 환경을 조성하였다. ALCAR의 자체독성을 확인해보기 위하여 0.001 ~ 100 μM 농도로 처리하였다. 0.001 ~ 1 μM 까지는 viability에 영향을 주지 않는 것을 확인하였고 따라서 Oxygen Glucose Deprivation (OGD)을 이용한 본 실험에서 0.001 ~ 1 μM 농도에서의 신경보호효과를 확인하였다. 그 결과 OGD 환경에 노출된 신경줄기세포에 ALCAR를 처리한 후 TBS assay를 통한 cell viability 의 회복과 TUNEL assay를 통한 apoptosis의 감소, CFU assay를 통한 cell proliferation의 회복을 확인할 수 있었다. 이런 신경보호효과가 어떤 경로를 통해서 이루어지는지 확인해보고자 Survival 경로인 PI3K pathway를 확인해보았다. ALCAR의 처리로 PI3K inhibitor인 PTEN은 감소하고 pAkt(Ser473), pGSK-3β(Ser-9)의 증가를 확인하였고 또 다른 세포생존에 관련된 Bcl2와 Ki67의 발현은 증가하였다. Protein의 발현을 다시 확인해보고자 Immunocytochemistry를 이용하여 ALCAR 처리 후 Ki67의 발현을 확인해보았고 Ki67의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 사멸에 관련된 Bax, cytochrome C, cleaved caspase-9, caspase-9, cleaved caspase-3, caspase-3의 증감을 확인할 수 있었다. 이런 결과를 고려할 때 ALCAR는 뇌졸중에 의한 신경세포사멸에 있어서 신경보호효과를 보이며 PI3K pathway를 통하여 이런 신경보호효과를 보여준다. 이런 ALCAR는 뇌졸중의 치료약의 개발에 도움이 될 수 있을 것이라고 생각된다.