헌팅턴씨병에서 PA28 gamma 와 resveratrol 의 신경 보호 효과에 관한 연구

Abstract

헌팅턴씨병은 우성 유전 질환으로 Exon 1 에 있는 헌팅틴 유전자에 CAG 의 반복의 비이상적 연장으로 인해 발생된 질병이다. 헌팅턴씨병은 인간의 뇌에 특정 부위인 선조체에 분포하는 가바성 가시 신경 세포의 특이적인 손상이나 사멸하는 특징을 가진다. 헌팅턴씨병 환자에서는 미상핵과 피질로 구성되어 있는 neostriatum 이라는 기저핵 부분에서 퇴행성 증상이 발견된다. 그러나 이러한 가바성 가시 신경 세포의 퇴행은 neostriatal 영역에만 국한된 것이 아니라, 흑색질, 대뇌 피질, 해마, 소뇌, 시상 및 시상 부분을 포함한 여러 지역에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 헌팅턴씨병 환자는 운동 장애, 인지 장애 및 정신 이상 증상 등 다양한 증상을 보인다. 이전 연구에 따르면 헌팅턴씨병의 중요한 메커니즘은 가바성 가시 신경 세포에서의 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 기능 저하, 미토콘드리아의 기능 저하, 세포 내 칼슘 항상성 조절 장애와 연관이 있음을 알 수 있다. 본 연구에서 우리는 이러한 헌팅턴씨병 모델 시스템을 통해 프로테아좀의 활성화와 미토콘드리아의 활성화를 통해 가바성 가시 신경 세포에 신경 보호 효과를 제공하여 헌팅턴씨병에 대한 잠재적인 치료 방법을 제시하고자 한다. 첫번째 실험 단계로, 우리는 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐에서 프로테아좀 활성제인 PA28γ 의 과발현이 어떠한 영향을 가지는지 연구하였다. 우리는 PA28γ의 지속적인 과발현을 위해 렌티 바이러스 형태의 PA28γ 를 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐와 정상 생쥐의 선조체에 각각 주입하였다. PA28γ 의 렌티 바이러스를 주입 후 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐에서 Peptidyl-glutamyl preferring hydrolytic (PGPH) 에 대한 프로테아좀 활성도의 급격한 증가뿐만 아니라, 신경 성장 인자인 BDNF 와 pro-BDNF 의 mRNA 와 단백질 발현양의 증가 또한 확인하였다. 추가적으로, YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐의 선조체에서 유비퀴틴 양성의 봉입체의 수가 감소하였음을 확인하였다. 마지막으로, YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐의 rotarod test를 통한 행동 능력 검사에서 상당한 개선을 보였다. 이와 같은 결과는 PA28γ 의 과발현이 헌팅턴씨병 동물모델 생쥐에서 유비퀴틴 프로테아좀 시스템의 향상과 더불어 행동 이상을 향상시킨 결과를 통해 헌팅턴씨병의 유전자 치료의 가능성을 시사한다. 마지막으로, 우리는 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐에 산화방지제인 Resveratrol 을 투여하여 헌팅턴씨병에서의 효과를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. Resveratrol 투여 후, 우리는 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐의 선조체에서 내인성 항산화 물질인 Glutathione 와 ATP 가 증가 되었음을 확인하였다. 투여된 Resveratrol 는 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐에 행동 이상을 향상 시킴을 확인하였다. 세포 실험에서, Resveratrol 은 헌팅턴씨병의 병리학적 증상에 대한 신경 보호 효과를 보였다. Resveratrol 은 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐의 선조체와 헌팅턴씨병 모델 선조체 유래 세포에서 미토콘드리아 분열을 담당하는 유전자인 Drp1 의 유전자 발현 정도를 증가시켰다. 또한, Resveratrol 은 헌팅턴씨병 모델 선조체 유래 세포에서 세포 내 칼슘 농도를 증가시켰다. 우리는 Drp1 유전자 발현 정도가 세포 내 칼슘 농도에 의해 조절 된다는 것을 발견하였다. 우리는 Resveratrol 이 칼슘 신호 전달 경로를 통하여 Drp1 유전자 발현 정도가 증가 된 것으로 추측한다. 또한, 우리는 Resveratrol 에 의한 칼슘 조절을 통해 미토콘드리아 기능이 역기 활성화 될 것으로 생각한다. 이와 같은 결과는 투여된 Resveratrol 로 인한 칼슘 항상성 조절이 Drp1 유전자 발현의 증가를 통한 미토콘드리아 기능의 향상뿐만 아니라 헌팅턴씨병의 병리학적 증상 회복의 역할을 할 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 헌팅턴씨병에서 PA28γ 의 과발현을 통한 유비퀴틴 프로테아좀 시스템의 향상과, Resveratrol 을 통한 미토콘드리아 기능의 활성과 세포 내 칼슘 항상성 조절이 신경 세포 보호 효과를 제공함을 알 수 있다. 이런한 요소들은 YAC128 헌팅턴씨병 모델 생쥐에서 행동 이상을 향상시켰다. 이로써 프로테아솜 활성제인 PA28γ 와 산화방지제인 Resveratrol 이 헌팅턴씨병에서 신경보호 및 운동능력 증가를 제공할 수 있는 치료적 가능성을 제시한다.|Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant disorder caused by an expansion of CAG repeats in exon 1 of the gene encoding huntingtin (Htt) protein. HD is characterized by selective degeneration of GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) in the striatum. In patients with HD, degenerative effects are found in a part of the basal ganglia called the neostriatum, which is composed of the caudate nucleus and putamen. The effects of this degeneration of GABAergic MSNs, however, are not localized to the neostriatal region, but spread to the substantia nigra, cerebral cortex, hippocampus, cerebellum, hypothalamus and parts of the thalamus. Consequently, HD patients show the symptoms of dyskinesia, cognitive impairment, and psychiatric abnormality. Previous evidences demonstrated that the critical mechanism of HD is dysfunction of the ubiquitin-proteasome system (UPS), mitochondrial dysfunction, and disruption of calcium homeostasis in GABAergic MSNs. Herein we attempt to present neuroprotective effects on GABAergic MSNs by proteasome activation and mitochondrial activation in HD model systems and suggest potential therapeutic approaches for HD. In the first series of experiments, we determined the effect of PA28γ overexpression in YAC128 HD model mice. To chronically overexpress PA28γ, we stereotaxically injected a lentivirus form of PA28γ into the striatum of littermate control and YAC128 HD mice. After lenti-PA28γ injection, YAC128 HD mice exhibited a significant increase of peptidyl-glutamyl preferring hydrolytic (PGPH) proteasome activity as well as the mRNA and protein levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and pro-BDNF. Additionally, the number of ubiquitin-positive inclusion bodies was reduced in the striatum of YAC128 HD mice. Finally, YAC128 HD mice showed significant improvement of latency to fall during the rotarod test. These data suggest that gene therapy with PA28γ can improve UPS function as well as behavioral abnormalities in HD model mice. We conducted a final series of experiments to determine the effect of antioxidants in HD by administering resveratrol (RSV) in YAC128 HD mice and HD model cells. After RSV administration, we detected increased levels of endogenous antioxidant, glutathione (GSH), and ATP levels in the YAC128 HD mice striatum. Administered RSV rescued the behavior defect in YAC128 HD mice. In the in vitro study, RSV treatment also displayed a neuroprotective effect on the HD pathological condition. Mitochondrial fission gene Drp1 expression level was increased in the RSV administered MT mice striatum and HD model cells. Moreover, RSV increased intracellular calcium levels in HD model cells. We found that Drp1 expression levels were regulated by intracellular calcium levels. We conjecture that RSV treatment increased Drp1 expression levels through the calcium signaling pathway. Also, we supposed that RSV activated mitochondrial function by calcium regulation. These results suggest that administered RSV controlled intracellular calcium homeostasis not only increases mitochondrial function by increasing Drp1 expression level, but also aids in the recovery of HD pathological symptom. Taken together, these results suggest that functional improvement of UPS by overexpression of proteasome activator PA28γ, and enhancement of mitochondrial function and intracellular calcium homeostasis by antioxidant RSV administration offers neuroprotective effects in HD. These factors demonstrate rescue of motor deficits and abnormal behaviors in YAC128 HD mice. In conclusion, our findings suggest proteasome activator PA28γ and antioxidant RSV can be prospective therapeutic targets for HD.; Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant disorder caused by an expansion of CAG repeats in exon 1 of the gene encoding huntingtin (Htt) protein. HD is characterized by selective degeneration of GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) in the striatum. In patients with HD, degenerative effects are found in a part of the basal ganglia called the neostriatum, which is composed of the caudate nucleus and putamen. The effects of this degeneration of GABAergic MSNs, however, are not localized to the neostriatal region, but spread to the substantia nigra, cerebral cortex, hippocampus, cerebellum, hypothalamus and parts of the thalamus. Consequently, HD patients show the symptoms of dyskinesia, cognitive impairment, and psychiatric abnormality. Previous evidences demonstrated that the critical mechanism of HD is dysfunction of the ubiquitin-proteasome system (UPS), mitochondrial dysfunction, and disruption of calcium homeostasis in GABAergic MSNs. Herein we attempt to present neuroprotective effects on GABAergic MSNs by proteasome activation and mitochondrial activation in HD model systems and suggest potential therapeutic approaches for HD. In the first series of experiments, we determined the effect of PA28γ overexpression in YAC128 HD model mice. To chronically overexpress PA28γ, we stereotaxically injected a lentivirus form of PA28γ into the striatum of littermate control and YAC128 HD mice. After lenti-PA28γ injection, YAC128 HD mice exhibited a significant increase of peptidyl-glutamyl preferring hydrolytic (PGPH) proteasome activity as well as the mRNA and protein levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and pro-BDNF. Additionally, the number of ubiquitin-positive inclusion bodies was reduced in the striatum of YAC128 HD mice. Finally, YAC128 HD mice showed significant improvement of latency to fall during the rotarod test. These data suggest that gene therapy with PA28γ can improve UPS function as well as behavioral abnormalities in HD model mice. We conducted a final series of experiments to determine the effect of antioxidants in HD by administering resveratrol (RSV) in YAC128 HD mice and HD model cells. After RSV administration, we detected increased levels of endogenous antioxidant, glutathione (GSH), and ATP levels in the YAC128 HD mice striatum. Administered RSV rescued the behavior defect in YAC128 HD mice. In the in vitro study, RSV treatment also displayed a neuroprotective effect on the HD pathological condition. Mitochondrial fission gene Drp1 expression level was increased in the RSV administered MT mice striatum and HD model cells. Moreover, RSV increased intracellular calcium levels in HD model cells. We found that Drp1 expression levels were regulated by intracellular calcium levels. We conjecture that RSV treatment increased Drp1 expression levels through the calcium signaling pathway. Also, we supposed that RSV activated mitochondrial function by calcium regulation. These results suggest that administered RSV controlled intracellular calcium homeostasis not only increases mitochondrial function by increasing Drp1 expression level, but also aids in the recovery of HD pathological symptom. Taken together, these results suggest that functional improvement of UPS by overexpression of proteasome activator PA28γ, and enhancement of mitochondrial function and intracellular calcium homeostasis by antioxidant RSV administration offers neuroprotective effects in HD. These factors demonstrate rescue of motor deficits and abnormal behaviors in YAC128 HD mice. In conclusion, our findings suggest proteasome activator PA28γ and antioxidant RSV can be prospective therapeutic targets for HD.