M13 bacteriophage-based color sensor as a simple screening tool for identification of phthalate species and discrimination of geographical origins of agriculture samples

Abstract

본 학위 논문에서는 M13 박테리오파지 기반 컬러센서를 활용하여 4 개의 유사한 프탈레이트 유도체를 확인하고, 그리고 농산물의 원산지를 판별하는 연구를 수행하였다. M13 박테리오파지 기반 컬러센서는 센서 표면에 M13 박테리오파지들이 자가조립된 나노구조체를 만들고, 이 구조체가 형성하는 광 결정구조를 이용해 타겟물질과 상호작용 시 야기된 광학적 성질 변화를 측정한다. 나노구조체의 간격 및 배열에 따른 외부 빛 파장의 보강 및 상쇄 간섭이 일어나는 원리를 통하여 다양한 구조색을 만든다. 컬러센서에 기화된 시료의 분자가 접촉되면 박테리오파지 나노구조체가 팽창하여 그 크기가 커지고 간격이 넓어져 장파장대의 색깔로 변하게 된다. 전하결합소자 카메라로 컬러센서의 색 변화 신호를 관찰한 데이터를 수집하여 분석하였다. 제 1 장에서는 비슷한 분자구조를 가진 시료의 판별 정확도를 향상시키는 연구를 수행하였다. 이를 위하여, 화학구조가 미세하게 다른 4 개의 프탈레이트((bis-(2-ethylhexyl)-phthalate (BEHP), dibutyl phthalate (DBP), diethyl phthalate (DEP), and benzyl-butyl-phthalate (BBP)) 판별을 시도하였다. BEHP, DBP, DEP, BBP 를 각각 컬러센서에 노출시킨 후 RGB 색상변화의 데이터를 수집하고 색 패턴의 변화를 관찰하였다. 프탈레이트 구조에 존재하는 작용기에 따라 컬러센서와 반응하는 정도가 달랐으며, 시료 중 가장 긴 알킬 체인을 가진 BEHP 가 네 가지의 시료 중 가장 미세한 색 변화를 나타냈고, 벤젠링을 가진 BBP 는 RGB 를 크게 변화시켰다. 이는 컬러센서 표면에 존재하는 tryptophan-histidinetryptophan 은 indole 과 imidazole 을 포함하고 있기 때문에 BBP 와 π-π 상호작용이 이루어져 네 가지 시료 중 가장 큰 컬러 변화를 야기하였다. 얻어진 RGB 색상변화를 이용해 각각 다른 프탈레이트를 판별하기 위해서 support vector machine (SVM)과 hierarchical SVM (H-SVM)을 사용하였다. SVM 을 이용한 판별 정확도는 87.1%였으며, H-SVM 을 사용할 경우 판별의 정확도가 90.1%로 향상되었다. 제 2 장에서는 M13 박테리오파지기반 컬러센서를 사용하여 세 가지 다른 농산물(마늘, 양파, 들깨)의 원산지 판별을 수행하였다. 각각의 농산물에서 발산되는 냄새분자들이 컬러 센서에 노출되면, 센서표면의 아미노산들과 냄새분자와의 상호작용이 이루어지며 박테리오파지 나노구조체 다발이 부풀어 오르게 되어 컬러센서 구조색 변화를 일으키게 되고, 만약 국산 농산물과 수입산 농산물의 냄새 성분이 다르면 원산지를 구별할 수 있을 수 있다는 가능성에 기반을 두고 연구를 진행하였다. 우선적으로, Glutamate 4 개가 연속으로 반복되는 박테리오파지로 자가조립한 컬러센서로 원산지 판별을 수행하였으며, 또한 판별을 위해 SVM 을 사용하였다. 그 결과 마늘, 양파, 들깨 시료의 원산지 판별 정확도는 각각 94.1, 88.7%, 91.6%였다. 하지만 농산물의 냄새분자들이 Glutamate 외에 다른 아미노산들과 특이한 상호작용을 할 가능성이 있기 때문에, 판별의 정확성을 높이기 위해 각각 다른 아미노산들을 포함한 세 가지 컬러센서를 (Wild sensor: glutamic acid (E)-glycine (G)-aspartic acid (D), WHW sensor: tryptophan (W)-histidine (H)-tryptophan (W), 4E sensor) 사용하여 각각 고유한 RGB 신호를 얻어 세 가지 RGB 신호를 결합한 데이터로 원산지의 판별 정확도를 향상시키고자 하였다. 각각의 컬러센서를 개별적으로 사용했을 때, SVM 기반 원산지 판별 정확도는 각각 마늘, 양파, 들깨에 대해 91.8-94.0%, 88.6-90.3%, 89.6-92.1%였다. 반면, 세 가지의 컬러센서 데이터를 통합시킨 결과 각각 98.0%, 97.5%, 97.1%로 향상되었다. 이와 더불어 농산물의 순수한 냄새 분자에 대한 각 센서의 상이한 색변화를 조사하기 위해 각 색 센서를 사용하여 알릴 이황화, 아릴 메틸 이황화, 페릴알데하이드를 (allyl disulfide, allyl methyl disulfide, and perillaldehyde) 측정하였고, RGB 신호의 차이를 분석하였다.; M13 bacteriophage-based color sensor, whose structural color changes by interactions of amino acid residues on the self-assembled phages with targeted gas molecules, has been demonstrated for identification of phthalate derivatives with similar chemical structures and discrimination of geographical origins of agriculture samples. M13 bacteriophage-based color sensor was composed of self-assembled filamentous bacteriophage, that is highly regular with a length of ~800 nm and a diameter of ~6.6 nm. In the first part, the discrimination of 4 phthalates with similar molecular structures (bis-(2-ethylhexyl)-phthalate (BEHP), dibutyl phthalate (DBP), diethyl phthalate (DEP), and benzyl-butyl-phthalate (BBP)) was attempted using WHW sensor (tryptophan (W)-histidine (H)-tryptophan (W)). The pattern and magnitude of the RGB color changes were different depending on the functional groups present in the phthalate structures. BEHP possessing a long alkyl chain resulted in a minute color change, while the variation of color was substantially large when BBP containing an additional benzene ring was measured. Since a tryptophan-histidine-tryptophan residue possessing indole and imidazole was present on the self-assembled phages, the π-π interaction of benzene in BBP with the sensor surface produced a considerably greater color change. To process RGB signals and discriminate these 4 phthalates, support vector machine (SVM) and also hierarchical SVM (H-SVM) was adopted to handle multi-class discrimination. The use of H-SVM improved the discrimination accuracy up to 90.1%, compared to 87.1% using SVM. The demonstrated color sensor is versatile and can be potentially adopted as an on-site screening tool. In the second part, the color sensor was evaluated as a screening tool for the discrimination of the geographical origins of three different agricultural products (garlic, onion, and perilla). Initially, the agriculture samples were measured with a repeating unit of four glutamate (4E) color sensor, and SVM was employed to discriminate the domestic and imported samples. The resulting accuracies in the measurements of garlic, onion, and perilla samples were 94.1, 88.7, and 91.6%, respectively. To improve the accuracy of discrimination, three different color sensors containing various amino acid residues (Wild sensor: glutamic acid (E)-glycine (G)-aspartic acid (D), WHW sensor: tryptophan (W)-histidine (H)-tryptophan (W), 4E sensor) were simultaneously employed. Each color sensor showed individually unique color changes. When each color sensor was used individually, the discrimination accuracies based on SVM ranged over 91.8-94.0%, 88.6-90.3%, and 89.6-92.1% for the discrimination of geographical origin of garlic, onion, and perilla samples, respectively. These improved to 98.0%, 97.5%, and 97.1%, respectively, by integrating all the RGB signals acquired from all the three color sensors for SVM. The individually characteristic as well as complimentary RGB signals acquired from the color sensors were cooperative in improving the discrimination accuracy. To examine the dissimilar responses of each color sensor to an odor molecule, typical odor components in the samples (allyl disulfide, allyl methyl disulfide, and perillaldehyde) were measured using each color sensor, and differences in their RGB signals were discussed.