허혈재관류 손상 치료를 위한 일산화탄소 방출 분자-3의 신기능 보호 효과 : 생체내 및 생체외 연구

Abstract

일산화탄소는 조직의 허혈재관류 손상 (ischemia reperfusion injury)이나 염증 반응을 줄여주는 것으로 알려져 있다. 하지만 일산화탄소를 바로 인체에 적용하기에는 여러 가지 위험성이 따르기 때문에 임상에서의 활용은 아직 미미한 상태이다. 이에 일산화탄소를 안전하게 조직까지 전달해줄 수 있는 일산화탄소 방출 분자 (carbon monoxide releasing molecule, CORM)가 개발되어 왔는데, 그 중 수용성 물질인 CORM-3가 신장의 허혈재관류 손상에 미치는 영향을 알아보고 이의 작용 기전을 분석하고자 하였다. 정상 신장 상피 세포주인 NRK-52E으로 in vitro 실험을 진행하였다. 허혈재관류 손상을 유발하기 위해서 세포주를 혐기성 챔버 (37°C, 95% nitrogen, 5% carbon dioxide)에 24시간 전처리 (ischemia) 후 정상 챔버에서 6시간 유지하였다 (reperfusion). 이에 CORM-3 및 불활성 CORM-3 (inactive CORM-3)를 농도별로 처리하여 24시간 후 cell viability assay (CCK assay)를 시행하였다. 또한 TNF-α mRNA induction (Q-RT PCR), C-caspase 3, Erk1/2, JNK, P38 (western blot)도 측정하였다. 생체내 (in vivo)에서 CORM-3의 효과를 확인하기 위해서 8주령 female SD rat의 우측 신장을 절제하여 단일 신장 모델을 만들었다. CORM-3의 정맥 내 주입 후 좌측 신장의 동맥과 정맥을 결찰하여 30분, 45분, 60분, 75분, 90분의 허혈재관류 손상을 유도하였다. 1일 뒤 혈청 크레아티닌을 비롯한 신장 손상 표지자인 KIM-1, β2-microglobulin, cystatin C를 측정하였고, 신장 조직에서 TUNEL assay, Sirius red staining 등을 시행하였으며, cDNA microarray를 통해서 CORM-3의 작용 기전을 알아보고자 하였다. In vitro 실험 모델에서 허혈재관류 손상을 받은 신장 세포주는 그렇지 않은 세포에 비교하여 약 70%가 사멸하였다. CORM-3는 농도에 비례해서 세포의 viability를 증가시켰으며, 200 µM 에서 세포의 viability를 약40% 증가시켰다. 허혈재관류 손상 후 TNF-α mRNA induction이 관찰되었으며, 이는 CORM-3를 처리한 군에서 낮아졌다, 또한 CORM-3를 처리한 군에서 apoptotic marker인 C-caspase 3의 발현이 낮았으며, oxidative stress markers인 p-JNK, p-P38의 발현 감소를 통해 CORM-3가 oxidative stress를 낮추는 것을 확인하였다. In vivo 실험에서 혈청 크레아티닌은 허혈 시간이 길수록 증가하였다. 30 분, 45 분 실험에서는 신장 손상이 충분하지 않아 그룹 간에 유의한 차이가 없었으나 75 분 이상의 허혈 시간의 경우 CORM-3를 투여한 군은 대조군보다 혈청 크레아티닌이 낮았다. 신장 손상 표지자인 KIM-1, β2-microglobulin, cystatin-C도 CORM-3 전처치 군에서 더 낮게 측정되었으며, 신장 조직의 병리학적 검사에서 정상 세뇨관과 사구체는 CORM-3 군에서 더 많이 보존되었다. TUNEL assay와 sirius red stain에서도 CORM-3 군에서 세뇨관 세포의 apoptosis 및 섬유화가 더 적게 확인되었다. cDNA microarray 결과 CORM-3 군에서 960개의 gene expression alteration이 발생하였으며, 이 gene들의 기능적 mechanism을 분석하였을 때, fatty acid degradation, cytochrome p450 등 metabolic pathway에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 결론적으로 CORM-3는 신장의 허혈재관류 손상을 감소시킨다. 특히 CORM-3는 metabolic pathway에 작용함으로써 신장 세포의 허혈재관류 손상 후 apoptosis를 줄여준다. 따라서 CORM-3의 전처치는 부분신장절제술이나 신장이식에서 허혈재관류 손상에 대한 새로운 치료 전략이 될 수 있을 것이다.