Development of thermally expandable and micropatterned hydrogels for harvest and delivery of stem cell spheroids

Abstract

줄기세포 배양 기술의 발전에 따라 줄기세포를 활용한 다양한 질환의 치료 기술이 등장하고 있다. 특히 3차원 배양된 줄기세포는 높은 생체 미세환경 모사도와 향상된 기능으로 인해 기존에 2차원으로 배양된 세포에 비해 개선된 치료 효능을 보이는 것으로 보고되어 왔다. 하지만 3차원으로 배양된 줄기세포를 질환부에 적용하기 위한 방법으로는 주사를 통한 체내 주입법이 유일하다. 주입을 통한 전달은 원하는 부위에 수술적인 처치 없이 줄기 세포를 간단하게 전달할 수 있지만, 주입된 세포의 대부분이 조직 내에 머물지 못하고 분산되어 치료 효과가 떨어진다는 단점이 있다. 또한 국소부위에만 처리 가능하고 주입과정에서 세포가 손상될 수 있는 문제가 있다. 따라서 이 논문에서는 마이크로웰 구조를 가진 온도감응성 하이드로젤을 이용하여 세포의 3차원 배양과 비침습적으로 세포를 전달할 수 있는 시스템을 구축하였다. 지방유래 줄기세포를 온도 감응성 하이드로젤 상에 배양하였을 때 구형의 3차원 줄기세포 집합체가 형성되는 것을 확인하였으며, 형성된 줄기세포 집합체가 2차원에서 배양된 줄기세포에 비해 향상된 성장 인자 분비능을 보이는 것을 확인하였다. 또한 차가운 식염수에 (4 °C) 10분간 처리하는 것만으로도 3D 줄기세포 집합체를 배양 기판에서 분리할 수 있었으며, 동물 모델을 이용하여 넓은 면적을 가진 피부 손상 부위에 3D 줄기세포 집합체를 고르게 도포 할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 기술은 줄기세포 치료제의 접근성을 획기적으로 높일 수 있을 것으로 기대된다; Stem cell spheroids have been widely used in regenerative medicine since they can provide the 3D environment, however, delivery of spheroids through a syringe has been shown issues to be addressed due to difficulty for homogenous injection in depth, limited coverage of large tissue defects and potential damage on cells induced by shear stress. To overcome the limitations, in this study, we developed one-step spheroid delivery platform enabling easy fabrication of spheroids with regular size and transfer of spheroids onto a large target site. Firstly, we fabricated a fibronectin-incorporated Tetronic® hydrogel which has a thermosensitive property. The hydrogels contained square shaped microwells which has 200 x 200 μm or 400 x 400 μm square patterns in 80 μm of depths. Then, human adipose derived stem cells (hADSCs) were assembled into spheroids within each microwell. The hADSCs spheroids were fabricated as the average size of 118.87 ± 2.68 μm at 2 x 105 cells/cm2 seeding density. In addition, the 96.70 ± 2.96 % of hADSC spheroids were bound on the micropatterned hydrogel due to fibronectin when an artificial shaking force was given by a shaker. To transfer hADSCs spheroids, the hydrogel containing spheroids within the microwells was applied to the target site. After changing the temperature, the expanded hydrogel was removed while remaining spheroids on the target site. The spheroids were homogenously transferred to the large target site with a transfer efficiency of 93.78 ± 2.30 % due to the expansion of the hydrogel. To determine the therapeutic effect in vivo, the hADSCs spheroids were successfully transferred on the excisional mouse wound model. As a result, the enhanced wound healing effects were demonstrated through increased the formation of blood vessel structure and matured collagen layer. Taken together, our results showed that advanced spheroids delivery system can be an effective method as cell therapy tools