Cannabinoid receptor 1에 의한 Leydig cell의 steroidogenesis에 관한 연구

Abstract

Cannabinoid receptor (CB)는 모두 7개의 막 관통 부위를 갖는 전형적인 G-protein coupled receptor로서 대마초 등 마약류에 존재하는 cannabinoid 혹은 생체 내 존재하는 anandamide (AEA)와 반응하여 다양한 신체적, 정신적 영향을 매개한다. 현재까지 2 가지의 cannabinoid receptor (CB1, CB2)가 뇌를 포함한 신경계, 전립선, 정관, 정소를 포함한 생식계, 면역계 및 소화계 등에서 발현하는 것으로 확인되었다. 이중 CB1은 주로 뇌에서 발현되며 정소 조직에서도 발현이 확인되었다. 그러나 정자형성과정과 steroidogenesis과정에서 CB1의 역할은 확실히 규명되지 않고 있다. 본 연구에서는 cannabinoid가 남성생식능력의 변화에 미치는 영향을 분자수준에서 규명하기 위한 연구의 일환으로 mouse Leydig tumor cell (mLTC-1)에서 CB1에 의한 steroidogenesis 조절을 이해하고자 하였다. mLTC-1에 CB1과 truncated CB1을 과발현하여 CB1 (C7)과 truncated CB1 (H20)에 대한 과발현 세포주를 확립하였다. C7 세포주는 mLTC-1과 비교하여 세포 모양이 동그랗고 뭉쳐서 자라는 특징을 보였으며, 성장속도가 느렸다. 세 가지 세포주의 progesterone 생성은 C7이 mLTC-1의 생성양에 비해 3 배 가량 높았고 H20은 가장 낮았다. mLTC-1의 경우 AEA에 의한 steroidogenesis의 저해효과가 농도의존적으로 나타났으므로 CB1에 의하여 steroidogenesis가 저해되는 것으로 보인다. AEA에 의한 영향을 연구하기 위해 세 가지 세포주 각각 human chorionic gonadotropin (hCG)을 이용하여 leutinizing hormone/chorionic gonodotropin (LH/CG)에 대한 수용체를 자극시키면서 AEA를 처리하였다. mLTC-1의 경우 AEA에 의해 progesterone 생성이 두드러지게 감소하였고, StAR, P450scc, 3β-HSD의 mRNA 수준도 동일하게 감소하였다. 이에 반해 C7에 AEA를 처리한 경우 progesterone 수치는 2배가량 증가하였고, StAR, 3β-HSD의 mRNA 수준은 감소하였다. H20의 경우 progesterone 수치는 변화가 없었고 유전자 발현이 약간 감소하였다. 결론적으로 AEA 자극은 hCG에 의한 효과를 mLTC-1에서는 상쇄시키고 C7에서는 증가시켰으며 H20에서는 감소시키거나 반응이 없었다. 이러한 결과는 Leydig cell에서 CB1은 LH/CG에 의한 steroidogenesis 신호전달기작에 중요한 억제요인으로 작동하며, CB1의 과도한 활성화는 역으로 steroidogenesis를 증가시키는 것으로 사료된다.; Cannabinoid receptor (CB) is one of the G-protein coupled receptors containing 7 transmembrane domains. Marijuana smoke, cannabinoid and endocannabinoid adversely affect various kinds of physical or psychic reactions through reacting with cannabinoid receptors. Only 2 kinds of CBs have been identified in different cells and tissues so far. CBs are consisted in brain, prostate gland, vas deferens, immune tissues, digestive system and several peripheral tissues including testis. However, to date, the spatiotemporal patterns of CB1 expression in the testis and its roles during spermatogenesis as well as steroidogenesis has not been well understood. In an effort to understand a regulation mechanism of steroidogenesis in testis by CB1, a mouse Leydig cell line (mLTC-1) which over-expresses CB1(clone C7) or a truncated CB1 (clone H20) were established, and their steroidogenic nature was characterized. C7 showed circular morphology, grew up slowly and formed cluster during culture. The amount of progesterone production in C7 was significantly higher (> 3 times) than that of the mLTC-1 cells. On the contrary, production amount of progesterone in H20 was the lowest among three cell lines. In mLTC-1 cells, arachidonylethanolamide (AEA) inhibited the production of progesterone with dose-dependent manner, indicating that activation of CB1 by endocannabinoid may have a negative effect on the steroidogenesis in Leydig cells. AEA (10 nM) increased progesterone production in C7, suggesting that overactivation of CB1 may reverse the effect of AEA on the steroidogenesis in Leydig cells. On the contrary, AEA did not alter progesterone production in H20. When stimulated by human chorionic gonadotrophin (hCG, 50 ng/ml), AEA significantly decreased the progesterone production with decreasing in StAR, P450scc and 3β-HSD mRNA level in mLTC-1 cells. In C7, by contrast, the production of progesterone was increased significantly by 2-fold while mRNA level of StAR and 3β-HSD were decreased. In H20, although mRNA level of StAR, P450scc and 3β-HSD were decreased, there were no significant changes in progesterone production. In conclusion, the results suggest that activation of CB1 inhibits steroidogenesis by possibly interrelationship with hCG/LH receptor signaling and that overactivation of CB1 enhances the steroidogenic ability of Leydig cells.