In Vitro Hepatocyte Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Bone Marrow

Abstract

배경/목적: 골수에 존재하는 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)는 섬유모세포의 형태를 가지는 세포로 자가재생 (self-renewal) 능력을 보이며 조골세포, 연골세포, 지방세포 등의 다양한 종류의 세포로 분화 가능성을 지니는 성체줄기세포 (adult stem cell)로 알려져 있다. 본 연구에서는 인간 유래 중간엽줄기세포를 배양조건에 따라 기능성 간세포로 분화 가능성을 증명하고자 하였다. 방법: 중간엽줄기세포는 전골수세포 배양 후 두단계 (분화단계 1 주, 성숙단계 5 주) 의 분화조건(20 ng/mL HGF, 20 ng/mL oncostatin M)에 따라 6 주 동안 배양하여 분화된 세포를 얻었다. 기능성 간세포로의 분화를 확인하기 위해 배양된 세포들로부터 RNA 를 추출하여 간세포의 표지자로서 albumin, alphafetoprotein (AFP), cytokeratin 18 (CK 18), glutamine synthase (GS)에 대해 RT-PCR 을 수행하였다. 또한, 글리코겐 저장능 (glycogen storage) 관찰을 위해 PAS stain 을 실행하였고, low-density lipoprotein (LDL) uptake 를 관찰하였다. 간세포로의 분화시 phospholipase D (PLD)가 분화 조절인자로서 관여하는지 알아보기 위해 PLD 활성을 측정하였고, 분화 중인 세포의 미세변화를 전자현미경을 통해 관찰하였다. 결과: 중간엽줄기세포를 기능성 간세포로 분화시킨 후 간세포의 발현인자인 albumin, CK 18, PEPCK 등의 유전자들은 점차 강하게 발현되었고, 글리코겐 저장능과 LDL 섭취율의 수준은 분화 3 주에 증가하였다. PLD 활성은 분화 1 주, 3 주에는 비슷한 양상이었으나 분화 30 분에 2 배 이상 상승하는 경향을 나타내어 분화 초기 단계에 간세포의 분화 조절인자로서 관여할 수 있는 가능성을 확인하였다. LM 과 EM 소견도 분화 초기에 간세포 모양으로 변화하여 분화초기에 형태학적으로 분화하는 것을 확인하였다. 결론: 인간 골수 유래 중간엽줄기세포가 기능성 간세포로 분화할 수 있음을 확인하였고, 이러한 결과로써 동물 모델에 구축된 배양조건에서 중간엽줄기세포를 이식하여 간세포로의 기능성을 증명함으로 임상적으로 기능성 세포치료를 가능하게 할 수 있을 것으로 생각된다.; Introduction: In addition to long-term self-renewal capacity, human mesenchymal stem cells (MSCs) possess versatile differentiation potential ranging from mesenchyme-related multipotency to neuroectodermal and endodermal competency. Of particular concern is hepatogenic potential that can be used for liver-directed stem cell therapy and transplantation. This study investsteigated whether human bone marrow-derived MSCs are able to differentiate into hepatocytes. Materials and methods: MSCs were cultured under 2-step protocol (differentiation and maturation) for 6 weeks with use of cytokines (epidermal growth factor, hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor) and oncostatin M. In the course of cell differentiation, cell morphology was observed by polarized LM as well as EM and phenotypic features and functions of hepatocyte were observed. Genes expressions in hepatocyte including albumin, alpha-fetoprotein, CK-18, CK-19, CPS, and glutamine synthetase were confirmed by RT-PCR. Hepatocyte functional activity was confirmed by glycogen storage and uptake of low-density lipoprotein (LDL). Phospholipase D (PLD) activity as differentiation factor was observed. Results: After 3 weeks of induction, cells showed cuboidal morphology, which are characteristic of hepatocytes, and expressed protein and liver cell specific mRNA such as albumin, CK 18, and PEPCK. The presence of stored glycogen, as determined by PAS staining, was visualized at 4 weeks following differentiation. After 6 weeks of differentiation, hepatocytes demonstrated the ability to uptake significant levels of LDL. In the early phase of differentiation, EM study revealed that differentiated cells showed hepatocyte features in terms of morphological change and cell organelles including Golgi body, mitochondria and endoplasmic reticulum by EM. PLD activity increased two-fold or more at the 30 minutes in the hepatic differentiation. Conclusions: Human bone marrow derived MSCs can be differentiated into hepatocytes or hepatocyte-like cells. The morphological and phenotypical changes into hepatocyte and differentiation could be decided at the early phase of differentiation. Based on these observations, this study suggested that human MSCs might retain hepatogenic potential suitable for cell therapy in early phase of differentiation.