다양한 스트레스에서 Haematococcus pluvialis의 생리적 변화와 peroxiredoxin 유전자의 발현 연구

Abstract

광합성 녹조류인 Haematococcus pluvialis는 astaxanthin이란 항산화 색소를 합성하여 극도의 산화스트레스에 적응할 수 있는 보호기작을 갖고 있다. 본 연구에서는 H. pluvialis에 고광도(high light)와 제초제인 methyl viologen (MV)을 처리하여 유도된 산화적 스트레스조건에서 생리적 변화를 알아보았다. HPLC를 이용한 색소분석 결과, 고광도 조건에서 astaxanthin이나 zeaxanthin, carotenoid의 양이 현저히 증가하였으나, MV로 3시간 동안 처리한 H. pluvialis에서는 색소변화를 보이지 않았다. Real time RT-PCR을 분석한 결과 astaxanthin 합성 관련 유전자인 isopentenyl pyrophosphate isomerase(IPP isomerase), phytoene desaturase(PDS), β-carotene ketolase(BKT), carotenoid hydroxylase(CHY)이 고광도 스트레스 조건에서 더 많이 발현되는 것이 관찰되었다. 본 연구실에서 제작된 H. pluvialis library에서 1개의 2-Cys, 3개의 TypeⅡ Prx, 1개의 PrxQ 총 5개의 putative Prx가 분리되었는데, 본 연구에서는 산화적 스트레스에서 발현차이를 보이는 2-Cys Prx(Hp2CP; DV203620)와 PrxQ(HpPrxQ; DV203749) 유전자의 특성 연구를 수행하였다. 염기서열로부터 유래된 아미노산서열 분석결과 두 개의 Prx가 Chlamydomonas reinhardtii의 2CP(79.1%), BCP로 추정되는 thioredoxin dependent peroxidase (61%)와 서열상 높은 유사성을 보였다. 또한, 다른 종의 유사 유전자의 아미노산 서열분석을 통해 각 Prx의 conserved cysteine의 위치를 비교하였고, 계통수를 통해 두 Prx가 다른 분기군에 존재함이 확인되었다. 산화적 스트레스에서 두 Prx의 전사 수준과 단백질 수준에서 변화를 알아 보기 위해 Northern blot과 real time RT-PCR, western blot을 수행하였다. Hp2CP와 HpPrxQ는 고광도 스트레스에서, mRNA와 단백질 수준이 모두 up-regulation 되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 MV를 처리한 실험구는, 단백질은 up-regulation 되고 mRNA는 down-regulation되었으며, 이 결과는 고광도 조건과 MV를 동시에 처리한 경우에서 동일하게 관찰되었다. 모든 스트레스 조건에서 HpPrxQ 보다 Hp2CP의 유전자가 신속하게 발현되는 것이 관찰되었다.; Haematococcus pluvialis is a photosyntehtic green alga, producing astaxnathin which is known to be antioxidatant pigment to protect the cell under extreme stress condition. In this study, general physiological effects in H. pluvialis under oxidative stress induced by high light and methyl viologen(MV) treatment were investigated. Results of HPLC analysis revealed that a large amount of carotenoids such as astaxanthin and zeaxanthin were accumulated under high light stress, but any pigment content was not changed under MV treatment for 3hr. The expression of genes which are related to astaxanthin biosynthesis such as isopentenyl pyrophosphate isomerase(IPP isomerase), phytoene desaturase (PDS) and β-carotene ketolase(BKT) were up-regulated in high light stress. Full of partial cDNA encoding five putative peroxiredoxins including one 2-Cys, three TypeⅡ Prxs and one PrxQ have been identified by searching the H. pluvialis database of expressed sequence tags (dbEST). Among these Prxs, 2- Cys Prx(Hp2CP; DV203620) and PrxQ(HpPrxQ; DV203749) were selected and further characterized. Deduced amino acid sequence of Hp2CP showed high sequence homology to the 2-Cys Prx(79.1%) of Chlamydomonas reinhardtii and expected to contain a chloroplast target sequence, and that of HpPrxQ encoded by partial cDNA showed high sequence homology with putative BCP (61%) of Chlamydomonas reinhardtii. The result of amino acid sequence alignment between HpPrxs and other known Prxs indicated that HpPrxs contained conserved cysteine in active site. Our phylogenetic analysis revealed that Hp2CP and HpPrxQ are not close to each other. The expression levels of Hp2CP and HpPrxQ transcripts and proteins were compared by using Northern blot, real time RT-PCR and Western blot. Both expression of transcripts and proteins of Hp2CP and HpPrxQ were upregulated under high light stress, but the expression levels of HpPrxs mRNA were decreased by MV treatment. Changes in the expression levels of transcript and protein of Hp2CP were more rapid compare to those of HpPrxQ.