Mchanism for Bcl-2 expression induced by bFGF in H19-7cells

Abstract

Bcl-2는 포유류에서 만들어지는 Bcl-2 gene family 중 하나로써 Bcl-xL, Bcl-W로 함께 anti-apoptotic 기능을 하는 단백질로 알려져 있다. 또한 melanoma, breast, prostate, lung carcinoma와 같은 cancer와 schizophrenia와도 관련되어있다. Cancer cell의 경우 apoptosis를 줄여줌으로써 암 치료를 어렵게 하고 schizophrenia같은 neurodegenerative 질병의 경우 Bcl-2 발현에 문제가 생기면 synapsis와 neuritis에서 apoptotic activity가 증가됨이 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 rat embryo의 hippocampus로부터 분리된 H19-7세포주를 이용하여 Bcl-2발현에 관여하는 신호 분자들을 연구하였다. 첫째 H19-7에 분화인자로 작용하는 bFGF를 처리하여 Bcl-2발현이 증가됨을 조사하였다. bFGF 처리 시 H19-7에서 PLCγ의 활성이 증가됨이 본연구실에서 조사된바 있어 PLCγ와 Bcl-2 발현과의 관계를 알아보기 위해 PLCγ 억제제인 U73122를 처리하여 감소함을 확인하였다. 또한 PLCγ 의 산물인 IP3의 영향을 알아보기 위해 intracellular Ca^(2+)chelator인 Bapta-am을 처리한 후 Bcl-2의 발현 줄어드는 것을 역시 관찰하였다. 둘째 IP3에 의해 방출되는 Ca^(2+)의 영향을 받는 하위 분자를 알아보기 위해 Bapta-am을 처리한 후 p-JNK와 p-ERK가 줄어드는 것을 확인하였다. 그리고 Bcl-2발현이 p-JNK 억제제인 SP600125와 MAPK 억제제인 PD98059에 의해 줄어드는 것을 확인하였다. 그러나 p-ERK와 p-JNK가 PLCγ 억제제인 U73122의 영향을 받는지 알아 본 결과 p-JNK의 경우는 U73122의 영향을 받았지만 p-ERK의 경우는 영향을 받지 않아 PLCγ 의 신호를 받지 않음을 알 수 있었다. 셋째로 따라서 p-ERK는 PLCγ의 신호가 아닌 Ca^(2+)의 영향을 받는 다른 신호분자의 하위에 있을 가능성을 조사하기 위해 PI3K 억제제인 LY294002를 처리하여 Bcl-2와 p-ERK 그리고 p-JNK를 조사한 결과 p-ERK와 p-JNK가 PI3K의 하위에서 작용하며 Bcl-2의 발현에 영향을 줌을 알 수 있었다. 넷째로 p-JNK와p-ERK 에 영향을 받는 전사인자를 조사한 결과 p-STAT3 (Ser727)과 p-STAT3 (Tyr705)가 영향을 받음을 알 수 있었다. 그러나 p-JNK 억제제인 SP600125는 STAT3 (Ser727)과 STAT3 (Tyr705)를 down regulation하나 PD98059를 처리하였을 때는 STAT3 (Ser727)만 감소함을 알 수 있었다. 또한 PLCγ, Ca^(2+)과 p-STAT3 (Ser727, Tyr705)와의 관계를 알아본 결과 PLCγ 억제제인 U73122를 처리한 경우는 p-STAT3 (Ser727)만 영향을 받고 p-STAT3(Tyr705)는 영향을 받지 않았다. 그러나 Ca2 억제제인 Bapta-am을 처리하였을 경우는 p-STAT3가 둘 다 영향을 받았다. 따라서 p-STAT3 (Ser727)는 PLCγ/JNK, 그리고 PI3K/ERK를 통해서 이루어지고 p-STAT3 (Tyr705)는 PI3K/JNK를 통해서 이루어짐을 알 수 있었다. 다섯째로 STAT3가 Bcl-2 발현에 관여하는 지를 알기 위해 STAT3 siRNA를 처리한 결과 Bcl-2발현이 감소됨이 관찰됨으로써 Bcl-2발현에 전사인자 STAT3가 관여함을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여보면 bFGF 처리 시 H19-7세포 주에서 STAT3를 경유하는 Bcl-2발현에는 3개의 신호경로 즉 PLCγ/JNK/p-STAT3 (Ser727, Tyr705)경로, PI3K/ERK/p-STAT3 (Ser727)경로 그리고 PI3K/JNK /p-STAT3 (Ser727, Tyr705)경로가 관여함을 규명하였다.; Bcl-2 has been known as an anti-apoptotic protein including Bcl-xL and Bcl-w. Recently, the data that Bcl-2 controls axonal growth have been reported. In spite of many studies about Bcl-2 functions, the molecular mechanism of Bcl-2 expression remains unclear. In this study, we have examined the signaling pathway leading to Bcl-2 expression in response to bFGF in H19-7 cells, hippocampal progenitor cells. First, we investigated whether bFGF treatment induces Bcl-2 overexpression in H19-7 cells. Based on our previous report that PLCγ is activated by bFGF, we inhibited PLCγ activity by introducing U73122, a PLCγ inhibitor into N2 medium to confirm that PLCγ regulates Bcl-2 expression. We found that PLCγ inhibitor significantly inhibited Bcl-2 expression induced by bFGF treatment. Second, we investigated the effects of Bapta-am, an intracellular Ca^(2+)chelator on Bcl-2 expression because IP3, the end product of PLCγ leads to Ca^(2+)release from ER(endoplasmic recticulum). We observed that the phosphorylation of JNK and ERK is inhibited by Bapta-am, resulting in decreasing of Bcl-2 expression. Even though Bapta-am affects both JNK and ERK, U73122 has no effect on ERK phosphorylation. It indicates there are two main pathways in Bcl-2 expression. Third, we examined the possibility that ERK might be a downstream molecule of PI3K by using LY294002, a PI3K inhibitor. In the present study, PI3K controls Bcl-2 expression through the phosphorylation of JNK as well as ERK. Finally, we found that ERK activation regulates the phosphorylation of STAT3 on Ser727 through PI3K pathway and JNK activation phosphorylates STAT3 on both sites (Ser727, Tyr705) through PLCγ and PI3K pathways ,which results in Bcl-2 overexpression. In conclusion, there are three signaling pathways involved in expressing of Bcl-2 in response to bFGF. Those are PLCγ/JNK/ STAT3 (Ser727, Tyr705), PI3K/JNK/STAT3 (Ser727, Tyr705), and PI3K/ERK/ STAT3 (Ser727).