HMGB 1 A box domain과 R3V6 peptide 기반의 유전자 전달체 개발

Abstract

R3V6는 친수성 arginine peptide 3개와 소수성 valine peptide 6개로 이루어진 양친매성 peptide이며, 수용액 상에서 micelle 형태를 이루는 특성을 갖고 있다. 이전 연구에서 R3V6 peptide(R3V6)를 기반으로 하는 유전자 전달체의 개발이 이루어진 적이 있으며, 상업적으로 사용되고 있는 유전자 전달체들에 비해 낮은 세포독성을 갖고 있음이 알려졌다. 본 연구에서는 R3V6와 또 다른 유전자 전달체 후보물질을 같이 사용함으로써, 낮은 세포독성이라는 장점을 유지하면서R3V6의 유전자 전달 효율을 개선할 수 있을 것이라는 가정하에 연구를 진행하였다. 후보물질로 선택한 High Mobility Group Box 1 A box domain(HMGA)는 최근 연구에서 유전자 전달 물질로 사용된 적이 있으며, Nuclear Localization Signal(NLS) peptide를 포함하고 있다. 본 연구에서는 HMGA를 R3V6와 복합적으로 사용하여 HMGA의 NLS 효과를 통해 R3V6의 유전자 전달 효율을 개선하고자 하였다. 실험결과, DNA/HMGA-R3V6 복합체(DNA/HMGA-RV)는 HMGA나 R3V6의 단독 사용에 비해 안정적인 복합체를 이루었으며, 비교군으로 사용한 Poly-L-lysine (PLL) 보다 안정성이 있음을 증명하였다. Luciferase assay를 통한 유전자 전달 효율 평가 실험에서, HMGA, R3V6를 개별적으로 사용하였을 때 보다 복합적으로 사용하였을 때 유전자 전달 효율이 극적으로 향상되는 결과를 나타내었다. 또한 PLL, Lipofectamine등의 비교 물질보다 더 높은 유전자 전달 효율을 나타냄으로써 두 물질의 유전자 전달 효율이 개선되었음을 증명하였다. 뿐만 아니라 복합체의 세포독성을 MTT assay를 통해 평가하였을 때, HMGA-RV 복합체는 매우 낮은 수준의 세포독성을 갖는 것을 확인하였다. 마지막으로 Confocal laser scanning microscopy 실험을 통해 HMGA의 NLS가 세포 내 유전자 전달 과정에 기여함을 증명하였다. 결론적으로 높은 유전자 전달 효율과 낮은 세포 독성 모두를 갖는 HMGA와 R3V6의 복합 사용이 제시되었다. 이 HMGA-R3V6 조합은 유전자 치료에 활용되는 효과적인 유전자 전달체로써 강력한 잠재력을 갖는다.| R3V6 is a gene carrier, which is composed with hydrophilic arginines and hydrophobic valines. In previous study, our group developed gene delivery carrier that based on R3V6 peptide. R3V6 formed micelles in aqueous solution and behaves larger molecular weight peptides for gene delivery. Furthermore, R3V6 have low cytotoxicity than commercially used carriers. And this characteristic is essential factor of gene delivery carrier. But the transfection efficiency was relatively low. So I decide to develop another peptide-based gene delivery carrier that to complement the shortcomings of R3V6 through combine use of R3V6 with the other candidate molecule. In this study, high mobility group box 1 box A domain (HMGA) is the other candidate that evaluated as a gene carrier in recent study. HMGA was used as a nuclear localization signal (NLS) peptide in combination with R3V6 for efficient plasmid DNA (pDNA) delivery. In this study, In vitro characterization data showed that the combined complex of HMGA and R3V6 (HMGA-RV) formed more stable complex with pDNA than poly-L-lysine (PLL), HMGA and R3V6 only. And also, through in vitro transfection assays, HMGA-RV had higher transfection efficiency than PLL, HMGA or R3V6 only at N2A cell. Furthermore, MTT assay suggests that HMGA-RV was not toxic to cells. At last, confocal laser scanning microscopy data proved that the NLS of HMGA could help the internalization of DNA. Therefore, HMGA-RV may be useful as a gene delivery carrier.; R3V6 is a gene carrier, which is composed with hydrophilic arginines and hydrophobic valines. In previous study, our group developed gene delivery carrier that based on R3V6 peptide. R3V6 formed micelles in aqueous solution and behaves larger molecular weight peptides for gene delivery. Furthermore, R3V6 have low cytotoxicity than commercially used carriers. And this characteristic is essential factor of gene delivery carrier. But the transfection efficiency was relatively low. So I decide to develop another peptide-based gene delivery carrier that to complement the shortcomings of R3V6 through combine use of R3V6 with the other candidate molecule. In this study, high mobility group box 1 box A domain (HMGA) is the other candidate that evaluated as a gene carrier in recent study. HMGA was used as a nuclear localization signal (NLS) peptide in combination with R3V6 for efficient plasmid DNA (pDNA) delivery. In this study, In vitro characterization data showed that the combined complex of HMGA and R3V6 (HMGA-RV) formed more stable complex with pDNA than poly-L-lysine (PLL), HMGA and R3V6 only. And also, through in vitro transfection assays, HMGA-RV had higher transfection efficiency than PLL, HMGA or R3V6 only at N2A cell. Furthermore, MTT assay suggests that HMGA-RV was not toxic to cells. At last, confocal laser scanning microscopy data proved that the NLS of HMGA could help the internalization of DNA. Therefore, HMGA-RV may be useful as a gene delivery carrier.