Relaxin H1또는 Relaxin H2이 세포고사와 항종양효과에 미치는 영향분석

Abstract

릴렉신 H2 는 2개의 펩타이드 사슬로 구성된 호르몬으로 릴렉신 H1과 90-95%의 염기서열상의 동일성을 가진다. 릴렉신 H2는 임신기간동안의 체내 순환과 그로 인해 나타나는 효과에 대해 활발히 연구되었으며, 이런 연구를 통해 릴렉신 H2가 릴렉신 H1과 H3에 비해 가장 강력한 생체활성을 나타낸다는 사실이 알려져 있다. 기존의 연구들로부터 고농도의 릴렉신 펩타이드의 발현은 암세포의 성장을 억제한다는 사실이 발표되었으며, 그와 더불어 생체 내에서 릴렉신에 장기간 노출되었을 경우 에스트로겐 독립적 종양에서 세포성장 및 항 침습성 특성이 나타난다는 사실이 보고되었다. 이와 유사하게, 우리 연구실에서 이뤄진 연구를 통해 릴렉신 H1의 종양 내 발현이 바이러스의 확산과 강한 항종양 효과를 유도한다는 사실을 발표한 바 있다. 종양 선택적 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료는 암의 치료의 유력한 후보중 하나이다. 종양 선택적 바이러스는 자가 복제가 가능하고 감염시킨 암세포를 파괴하며 이를 통해 주변의 다른 암세포에 이차 감염을 유도할 수 있는 등의 이점을 가지고 있다. 게다가 종양 선택적 살상 아데노 바이러스는 강력한 치료유전자를 삽입하여 운반할 수 있다. 하지만 종양 선택적 아데노바이러스의 이용은 이 바이러스가 가지는 종양 내 투과와 확산이 쉽지 않다는 단점을 가지고 있다. 성공적인 항종양 치료를 위해서는 종양 선택적인 복제와 암 조직 내에서 원활한 확산이 필히 요구된다. 본 연구에서는 암의 효과적인 치료를 위하여 릴렉신 H2를 발현하는 복제불가능 바이러스와 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 구축하였고, 이들의 항종양 효과를 in vitro와 in vivo 실험에서 검증하였다. 실험을 통해, 바이러스에 의해 매개되는 릴렉신 H2의 발현이 암세포의 세포고사를 유도함과 동시에 고형 종양에서 바이러스의 확산을 증대시켜 강력한 항종향 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 실험실에서 구축한 릴렉신 H2 발현 바이러스에 의한 릴렉신의 발현을 ELISA를 통하여 확인하였을 때 복제 불가능 아데노바이러스와 종양 선택적 살상 아데노 바이러스 모두 릴렉신 H2의 발현이 원활히 일어남을 확인할 수 있었다. CPE와 MTT 실험을 통해 릴렉신 H2 발현 아데노바이러스가 릴렉신 H1을 발현하는 바이러스에 비해 더 월등한 세포살상효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, in vitro TUNEL assay를 통해 아데노바이러스에 의해 발현된 릴렉신 H2가 암세포의 세포고사를 유도함으로서 앞 실험에서 확인되었던 세포살상효과의 유래를 확인하였다. 이러한 세포살상효과가 생체 내에서도 동일하게 일어나는지 확인하기 위하여 누드마우스 종양모델에서 릴렉신 발현 종양 선택적 살상 아데노 바이러스의 항종양 효과를 실험하였다. 이 실험을 통해 암조직에서의 릴렉신 H2의 발현이 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 확인하였다. 또한 스페로이드를 이용한 실험에서 바이러스에 의해 매개되는 릴렉신 H2의 발현이 종양 내에서 세포고사와 함께 바이러스의 확산을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다. RT-PCR 결과를 통해 릴렉신에 의한 항종양 효과가 MMP 효소군의 발현의 조절과 트랜스포밍 성장인자 (TGF-β)의 발현의 억제를 통해 나타난다는 사실을 확인하였다. 이런 세포내 변화는 세포외 기질의 합성을 저해함과 동시에 종양의 전이또한 억제할 것이라고 생각할 수 있다. 본 연구에서는 릴렉신 H1에 비해 매우 짧은 반감기를 가지는 릴렉신 H2가 비슷한 치료 효과를 나타냄을 확인하였다. 이러한 치료효과는 릴렉신 H2의 세포고사를 유도하고 세포외기질을 분해하는 특성에 의해 나타난다고 할 수 있다. 세포고사와 세포외기질 분해는 바이러스의 종양 내 확산과 다른 암세포로의 이차감염을 확대 시키게 되고 이에 따라 종양내 릴렉신 H2의 발현기간 및 농도를 일정기간 유지시키는 효과를 나타내게 되고 결과적으로 항종양 효과로 이어지게 된다고 설명할 수 있다. 이번 연구를 통해 릴렉신 H2를 발현하는 종양 선택적 아데노바이러스에 의해 증대되는 릴렉신 H2의 발현이 항종양 효과와 연결될 수 있음을 확인하였고, 릴렉신 H2 발현 종양 선택적 살상 아데노바이러스가 암의 유전자 치료에 있어서 유망한 후보가 될 수 있음을 확인 하였다.|Relaxin H2(RLX2) is a dimeric peptide hormone, which share 90-95% sequence homology with a Relaxin H1(RLX1). RLX2 is the most widely studied the significance and characterized profile of circulating body during pregnancy and the understanding that RLX2 retains the greatest bioactivity compared to RLX1 and relaxin H 3(RLX3). From the previous study, high level of RLX peptide inhibits tumor growth in high level of peptide concentration. In addition, Long-term exposure to Relaxin (RLX) confers growth inhibitory and anti-invasive properties in estrogen-independent tumors in vivo. Similarly, our previous study demonstrated that intratumoral expression of RLX1 expression could enhance viral spreading and induce potent antitumor effect. Oncolytic adenovirus (oAd) therapy is one of the gene therapies to treat cancer. oAd has many advantages, including the abilities to self-propagate, lyse infected cancer cells, and cause secondary infection of adjacent cells within a tumor. Moreover, oAds can carry powerful therapeutic gene. However, the use of dAds was limited by their uneven penetration and distribution in tumors. Successful anticancer treatment depends on the selective replication and spread of oncolytic Ads within cancer cells and tissues. In our current study, we constructed replication-incompetent and oncolytic Ad expressing RLX2 and evaluated its anticancer effect in vitro and in vivo. We demonstrate that Ad-mediated expression of RLX2 can induce tumor cell apoptosis and facilitate viral spreading in solid tumors, resulting in potent antitumor efficacy. We find that RLX2 is well expressed both replication incompetent and oncolytic Ads following dose-dependent manner. Through the CPE and MTT assay, we revealed RLX2-expressing Ads tended to exhibit enhanced cytopathic effect compare with RLX1-expressing Ads. RLX2 expressed from Ads are associatedwiththeincreasedlevelofapoptosis,whichcomplies with previous cell killing effect results. In vivo antitumor study demonstrated that RLX2 expression in tumor region could suppress tumor growth efficiently and extend survival rate of treated animal. From the Transduction efficiency test using tumor spheroids, RLX2-expressing Ad treatment induce apoptosis and wider replication of Ad in the tumor tissue directly connected to cancer cell killing effect. RLX2 expression in the tumor can regulated MMP family and TGF-b expression level. RLX2 expression inhibits tumor metastasis and ECM synthesis. We confirm that despite of RLX2 gene has much shorter half-life of mRNA compared with RLX1 gene and exhibit similar therapeutic potential with RLX1. Further, the RLX2-expression in the tumor tissue induces both apoptosis and ECM degradation, which improves of distribution of virus to infect more cancer cells. This can be increases period of RLX2-expression and maintain RLX2 peptide concentration in the tumor to induce antitumor effect. We believe that prolonged RLX2 expression in tumor outstand antitumor property of RLX2.; Relaxin H2(RLX2) is a dimeric peptide hormone, which share 90-95% sequence homology with a Relaxin H1(RLX1). RLX2 is the most widely studied the significance and characterized profile of circulating body during pregnancy and the understanding that RLX2 retains the greatest bioactivity compared to RLX1 and relaxin H 3(RLX3). From the previous study, high level of RLX peptide inhibits tumor growth in high level of peptide concentration. In addition, Long-term exposure to Relaxin (RLX) confers growth inhibitory and anti-invasive properties in estrogen-independent tumors in vivo. Similarly, our previous study demonstrated that intratumoral expression of RLX1 expression could enhance viral spreading and induce potent antitumor effect. Oncolytic adenovirus (oAd) therapy is one of the gene therapies to treat cancer. oAd has many advantages, including the abilities to self-propagate, lyse infected cancer cells, and cause secondary infection of adjacent cells within a tumor. Moreover, oAds can carry powerful therapeutic gene. However, the use of dAds was limited by their uneven penetration and distribution in tumors. Successful anticancer treatment depends on the selective replication and spread of oncolytic Ads within cancer cells and tissues. In our current study, we constructed replication-incompetent and oncolytic Ad expressing RLX2 and evaluated its anticancer effect in vitro and in vivo. We demonstrate that Ad-mediated expression of RLX2 can induce tumor cell apoptosis and facilitate viral spreading in solid tumors, resulting in potent antitumor efficacy. We find that RLX2 is well expressed both replication incompetent and oncolytic Ads following dose-dependent manner. Through the CPE and MTT assay, we revealed RLX2-expressing Ads tended to exhibit enhanced cytopathic effect compare with RLX1-expressing Ads. RLX2 expressed from Ads are associatedwiththeincreasedlevelofapoptosis,whichcomplies with previous cell killing effect results. In vivo antitumor study demonstrated that RLX2 expression in tumor region could suppress tumor growth efficiently and extend survival rate of treated animal. From the Transduction efficiency test using tumor spheroids, RLX2-expressing Ad treatment induce apoptosis and wider replication of Ad in the tumor tissue directly connected to cancer cell killing effect. RLX2 expression in the tumor can regulated MMP family and TGF-b expression level. RLX2 expression inhibits tumor metastasis and ECM synthesis. We confirm that despite of RLX2 gene has much shorter half-life of mRNA compared with RLX1 gene and exhibit similar therapeutic potential with RLX1. Further, the RLX2-expression in the tumor tissue induces both apoptosis and ECM degradation, which improves of distribution of virus to infect more cancer cells. This can be increases period of RLX2-expression and maintain RLX2 peptide concentration in the tumor to induce antitumor effect. We believe that prolonged RLX2 expression in tumor outstand antitumor property of RLX2.