국내 Clostridioides difficile 균주의 whole-genome sequencing을 통한 특성 비교 분석

Abstract

서론: Clostridioides difficile(CD)감염은 병원 관련 감염성 설사의 주요 원인균으로, 최근 유병률 및 사망률의 증가로 인해 전세계적으로 문제가 되고 있다. CD감염은 무증상부터 사망에 이르는 중증감염까지 다양한 경과를 보이는데, 이는 감염된 숙주의 면역 상태와 다양한 균의 형질에 의하여 결정된다. 균의 형질은 CD에 특징적인 toxinA, toxinB 관련 유전자 및 균주의 전파, 이동, 부착, 적응 및 생존과 관련된 다양한 유전자에 의해 결정되며 항생제 내성도 중요한 형질 중 하나이다. 이와 관련된 균주 특성의 전반적 분석을 위해 최근에는 전장유전체분석(Whole-Genome Sequencing, WGS)을 통한 분석법이 시도되고 있다. 이에 본 연구는 국내에서 수집된 CD균주를 대상으로 WGS을 통한 형질에 영향을 줄 수 있는 다양한 유전학적 특성을 규명하고 이를 균주 별로 비교 분석하고자 하였다. 방법: 2009년 1월부터 2013년 12월까지 한양대학교병원에서 수집된 35개의 균주를 대상으로 DNA를 추출하였고, Miseq장비를 통해 염기서열분석을 시행하였다. Megahit를 이용하여 재조합(assemble)을 시행하였고, Prokka를 이용하여 어노테이션을 실시하였다. SRST2를 이용하여 Multilocus Sequence Typing (MLST)을 실시하고, CD-HIT를 이용하여 오솔로그 유전자 clustering을 통해 코어 유전자(core genes)를 선별하였으며, 이를 이용하여 계통분석을 실시하였다. A&B독소 관련 유전자를 포함하는 pathologic locus (PaLoc)분석은 드 노보 어셈블리(de novo assembly) 한 염기서열의 경우 MEGA를 이용하여 수기로 비교 분석하였고, CD630(gene bank accession number: AM180335)을 통한 레퍼런스 시퀀스 기반분석은 IGV (Interactive Genomics Viewer)를 이용하여 시각화하여 비교분석하였다. 항생제 내성 관련 유전자 분석은 CARD 및 SRST2를 사용하였고 비독소 독성인자(non-toxin virulence factor)관련 유전자 분석은 CD-HIT를 통해 오솔로그 유전자 clustering을 실시하여 이를 균주 별로 비교하였다. 결과: 오염된 3균주를 제외한 32개 균주에서 분석을 완료하였다. MLST분석을 통해 sequencing type(ST)17이 8균주(25.0%), ST3, ST5가 각각 4균주(12.5%), ST53, ST35가 3균주(9.4%), ST8, ST11이 2균주(6.3%), ST2, ST14, ST129, ST54, ST192, ST37이 각각 1균주(3.1%)씩 확인되었다. 코어유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 활용한 계통분석은 MLST에 의한 분석과 유사하게 ST 및 clade에 따라 clustering되었으나, 동일 clade내에서의 clustering의 패턴이 MLST와 차이를 나타내었으며 일부 균주에서는 수집된 기간에 따라 동일 ST내에서 분기가 발생하였다. PaLoc분석에서는 레퍼런스 시퀀스 기반 분석을 통해 대부분의 균주가 ST에 따라 유사한 부위에서 염기서열 변화가 관찰되었고 binary toxin (CDT)양성인 ST5, ST192, ST11균주는 CD630과 전체적인 불일치 소견을 보였으며, toxin 음성인 ST37 균주에서는 레퍼런스 시퀀스에 위치지정(mapping)되지 않는 소견이 관찰되었다. 반면, 드 노보 어셈블리 기반 분석에서는 ST5 균주에서 9 kb의 염기서열 삽입을 확인하였으며, ST37 균주에서는 tcdA유전자의 1.8kb 결실을 확인하였다. comprehensive antibiotic resistance database (CARD)를 이용한 항생제 내성 획득 유전자 분포는 주로 ST에 따른 분포와 일치하였으나 AAC(6’)-Ib-APH(2’)-Ia, ANT(6), ermB, catD, tetM 유전자는 같은 ST내에서도 수집된 기간에 따라 존재여부에 차이가 발생함을 확인하였다. 이러한 결과는 CD-HIT를 이용한 오솔로그 유전자 분석 및 SRST2를 이용한 분포에서도 유사하였다. 항생제 내성 관련 유전자 중 gyrA유전자의 Thr82Ile, gyrB유전자의 Ser366Ala 아미노산 서열변화가 fluoroquinolone 내성 균주에서 확인되었고, rpoB유전자에서 Gln489Leu, Pro511Thr, Ser550Phe 아미노산 서열변화가 rifaximin에 내성을 나타낸 균주에서 확인되었다. 비독소 독성 유전자(non-toxin virulence gene)분석에서 부착과 관련된 유전자들은 대부분 모든 균주에서 존재하였으나 이 중 cwp66, slpA유전자는 레퍼런스 시퀀스와 불일치를 나타내었고 cwpV유전자 및 CD630_33920, CD630_03860과 CD630_31450부위는 ST에 따라, 혹은 ST내에서도 차이를 나타내었다. 운동성 관련 유전자에서는 1개 균주를 제외한 모든 균주에서 관련 유전자가 존재함을 확인하였고, 포자화(sporulation)와 영양화(germination)에 관련돤 유전자 역시 cotF, bclA1, bclA2의 일부 유전자를 제외하고 모든 균주에서 확인되었다. 세균의 적응 혹은 생존과 관련이 있는 것으로 알려진 독성 유전자 중 ethanolamine 분해와 관련된 유전자 클러스터가 ST35 3개 균주 및 ST3 3개 균주에서는 존재하지 않음을 확인하였다. 결론: 국내 CD 균주의 전장유전체 분석을 통한 병독성 및 항생제 내성 관련 유전자의 균주 별 분포는 대부분 MLST에 의한 분류와 유사하였으나, 일부 항생제 내성 관련 유전자 및 독성 유전자는 균주에 따라 변이가 발생하거나 획득에 의해 다양한 변화를 나타내었다.