Non-integrating direct conversion using mRNA into hepatocyte-like cells

Abstract

간세포 유사세포에 mRNA를 사용하는 비 직접 형질전환

배경: 최근 여러 연구자들은 직접교차분화(Direct conversion)가 다 능성(pluripotent)의 중간 단계 없이 섬유아세포를 간세포 유사 세포(Hepatocyte-like cell)로 분화하는데 사용될 수 있다고 보고했다. 그러나 변환을 위한 바이러스 벡터의 사용은 바이러스의 유전자가 숙주의 유전자 사이에 통합될 수 있다는 문제점이 지속적으로 제기되고 있다. 본 연구에서는 잠재적인 임상 적용과 유전자 통합이 없는 직접교차분화의 새로운 방법을 제시한다. 방법: 간세포 유사 세포를 생성하기 위해, 간세포 전사 인자인 Foxa3 및 HNF4α를 코딩하는 mRNA를 마우스 배아 섬유아세포에 형질 감염시켰다. 10-12 일 후, 섬유아세포가 상피세포의 형태로 전환되어 간세포 유사 세포 (R-iHeps)의 콜로니를 생성 하였다.

결과 및 토의: 생성 된 R-iHeps는 albumin, alpha-fetoprotein, HNF4α, CK18 및 CYP1A2를 포함하는 간세포 특이적인 마커 유전자 및 단백질을 발현시켰다. 간 기능을 평가하기 위해 indocyanine green uptake, periodic acid-Schiff 염색 및 albumin 분비를 평가 하였다. 또한, mCherry 표지된 R-iHeps는 Alb-TRECK / SCID 마우스의 간에 이식되었으며, 또한 Fah1RTyrc / RJ 모델에 이식했을 때 FAH 효소를 발현하는 것을 확인했다. 결론적으로, 우리의 데이터는 mRNA를 사용하는 비 통합 방법이 세포 치료의 가능성이 있음을 시사한다.; Recently, several researchers have reported that direct reprogramming techniques can be used to differentiate fibroblasts into hepatocyte-like cells without a pluripotent intermediate step. However, the use of viral vectors for conversion continues to pose important challenges in terms of genome integration. Herein, we propose a new method of direct conversion without genome integration with potential clinical applications. To generate hepatocyte-like cells, mRNA coding for the hepatic transcription factors Foxa3 and HNF4α was transfected into mouse embryonic fibroblasts. After 10-12 days, the fibroblasts converted to an epithelial morphology and generated colonies of hepatocyte-like cells (R-iHeps). The generated R-iHeps expressed hepatocyte-specific marker genes and proteins, including albumin, alpha-fetoprotein, HNF4α, CK18, and CYP1A2. To evaluate hepatic function, indocyanine green uptake, periodic acid–Schiff staining, and albumin secretion were assessed. Furthermore, mCherry-positive R-iHeps were engrafted in the liver of Alb-TRECK/SCID mice, and we confirmed FAH enzyme expression in Fah1RTyrc/RJ models. In conclusion, our data suggest that the non-integrating method using mRNA has potential for cell therapy.