NF-κB/mTOR-mediated autophagy can regulate diquat-induced apoptosis in PC12 cells

Abstract

자가소화작용과 세포자살은 농약에 의한 신경독성에서 나타나는 중요한 세포사멸 기전으로 알려져 있다. 그러나 자가소화작용은 세포사멸을 억제하는 또다른 역할로 알려져 있어 이 둘의 관계성에 대해 많은 연구들이 진행되고 중요성이 대두되어 졌다. 이번 연구에서는 현재 농가에서 제초제로 흔히 쓰이고 있는 diquat(DQ)가 신경세포독성을 일으키고, DQ에 의한 자가소화 작용과 세포 자살의 어떠한 연관성이 있는지 알아보고, 자가소화작용 기전을 이용하여 DQ의 신경세포독성에 대해 새로운 약물요법을 연구하고자 하였다. 도파민을 분비하는 특징을 가진 PC12 세포주에서 DQ는 농도의존적으로 생존률과 도파민 분비량이 감소시켰고, 세포독성은 증가시켰다. 또한 DQ를 처리한 PC12 세포 주에서 cleaved caspase-9과 cleaved caspase-3의 발현이 증가하였고, 핵 응축 현상 또한 관찰되었다. 자가소화작용의 표시로 알려진 LC3-II와 p62의 발현 증가는 DQ가 자가소화작용을 일으켰음을 시사하였다. 또한, DQ는 항산화제에 의해 자가소화작용과 세포사멸이 줄어드는 것을 확인함으로써, DQ의 독성은 세포 내 활성산소에 의한 영향인 것으로 간주되어 졌다. 한편, p53과 NF-κB 신호전달체제는 자가소화작용과 세포사멸에 있어서 중요한 매커니즘으로, p53의 억제제인 pifithrin-α (PFT-α)와 NF-κB 억제제인 SN50을 통해 세포사멸과 자가소화작용이 감소됨을 확인함으로써 DQ는 p53과 NF-κB 신호전달체제와 관련한 매커니즘에 기여함을 알 수 있었다. MAPK 신호전달체제 또한 자가소화작용과 세포사멸에 중요한 매커니즘으로 알려져 있다. DQ를 처리한 PC12 세포주에서 MAPK kinases (ERK, JNK, p38)의 인산화를 확인하고, MAPK kinases의 각 억제제를 사용하여 mTOR signaling 조절을 통해 자가소화작용을 줄어들어 세포자살이 억제되어짐을 확인하였다. 따라서, DQ는 MAPK kinases pathway에 의존적인 세포신호전달에 관여하며, MAPK kinase의 억제제는 mTOR signaling을 통해 자가소화작용 조절하여 세포자살을 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 한편, 자가소화작용은 양면성을 가지고 있어서 이를 검증하기 위해 자가소화작용의 유도제와 억제제를 사용하였다. 유도제인 rapamycin을 전 처리한 PC12 세포주에서 DQ에 대한 자가소화작용이 더욱 증가되어 세포자살을 효과적으로 억제하고 생존률을 증가시켰다. 반면, 자가소화작용의 억제제인 3-methyl-adenine (3MA)을 통해 DQ에 의한 자가소화작용을 억제함으로써 세포 자살을 더욱 증가시켜 생존률을 더 떨어뜨렸음을 확인하였다. 본 연구의 결과로 DQ 인한 세포자살은 자가소화작용 조절을 통해 신경세포보호 효과를 확인하였고, 이러한 신경독성 관련 매커니즘 연구가 신경퇴화관련 질병 및 약물치료 요법에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다; Autophagy and apoptosis are the major mechanism of cell death in herbicide or pesticide-induced neurotoxicity, but autophagy is also known to play a role in cell protection by inhibiting apoptosis. In this study, we characterized the relationship between autophagy and apoptosis in diquat(DQ)-induced cytotoxicity and explored a novel pharmaco-therapeutic approach involving autophagy regulation to prevent DQ neuro-toxicity. DQ was cytotoxic to PC12 cells in a concentration-dependent manner (5 - 40 μM), as shown by decreased cell viability and decreased dopamine levels. DQ-induced apoptosis was found in PC12 cells, as demonstrated by activation of caspase-3 and caspase-9 and by nuclear condensation. By monitoring expression of LC3-II and p62, we found DQ induced autophagy. Also, exposure of PC12 cells to DQ led to the production of ROS, and N-acetyl-cysteine (NAC) antioxidant effectively blocked both apoptosis and autophagy. Interestingly, DQ in PC12 cells showed increased p53 and NF-κB in a time-dependent manner; furthermore, pifithrin-α (PFT-α), a p53 inhibitor, down-regulates the cytotoxicity of DQ, as shown by decreased LC3-II and cleaved caspase-3. SN50, an NF-κB inhibitor, results in diminished LC3-II, cleaved caspase-3, and p53. DQ induces MAPK signaling including ERK, JNK, and p38, which inhibit regulated apoptosis and autophagic cell death by controlling mTOR signaling. Pretreatment with rapamycin, an autophagy inducer significantly enhanced the viability of DQ-exposed cells by alleviating DQ-induced autophagy. Conversely, cell pretreatment with 3-methyladenine (3MA), an autophagy inhibitor increased DQ toxicity. Our results suggest that DQ-induced cytotoxicity is modified by autophagy regulation. Pharmacologic induction of autophagy may be a useful treatment strategy in neuro-degenerative disorders.