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Development of an single-stranded DNA aptamer for diagnosis and inhibition of the highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1

Title
Development of an single-stranded DNA aptamer for diagnosis and inhibition of the highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1
Other Titles
고병원성 조류독감 바이러스(H5N1) 진단 및 저해를 위한 단일핵산 압타머 개발
Author
Jae-Woo Choi
Alternative Author(s)
최재우
Advisor(s)
윤문영
Issue Date
2019-02
Publisher
한양대학교
Degree
Master
Abstract
조류독감은 야생 수생조류에서 자연적으로 발생하는 조류독감 A 바이러스의 감염에 의해 발생하는 바이러스성 전염병으로, 높은 사망률과 전염 속도가 빠르기 때문에 가금류 시장에 심각한 피해를 입힌다. 특히 고병원성 조류독감은 조류에서 사람으로 직접 감염이 되며, 사람에게도 높은 사망률을 보인다. 조류독감의 진단은 현장에서 정확한 하위유형을 알아내 신속히 고병원성과 저병원성을 판별하는 것이 중요하다. 현재 사용되고 있는 진단 방법은 검체를 채취하여 바이러스를 분리하거나 유전학적 검사를 통해 하위유형을 알아낸다. 이런 방법들은 정확한 하위유형을 알아내는데 시간이 오래 걸리며, 연구실 내에서 이루어지기 때문에 현장진단이 가능한 새로운 진단 방법이 필요한 상황이다. 또한 현재 조류독감 치료에 있어 항 바이러스제를 사용하는데, 항 바이러스제는 내성이 나타나 치료제의 효과가 감소하거나 질병 발병 후 48시간 내에 복용해야만 효과를 내는 등의 문제를 가지고 있어 새로운 기작을 갖는 조류독감 치료제의 개발이 필요하다. 따라서 이 연구에서는 고병원성 조류독감 바이러스(H5N1)를 목표 물질로 선정하여 안정적이고 결합력이 좋은 DNA 압타머를 발굴하기 위한 실험을 진행하였다. H5N1에 특이적인 압타머를 찾기 위해, 먼저 5′ 끝과 3′ 끝 부분에 각각 15개의 뉴클레오티드를 가지고 중간에는 30개의 무작위 뉴클레오티드를 갖는 DNA 서열을 PCR을 통하여 증폭한 후, 이를 사용하여 멤브레인 컬럼 튜브를 이용한 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponenetial enrichment)를 진행하였다. 일반적인 SELEX 과정에서 포함되는 목표 물질을 고정하는 과정 없이, incubation을 통해 30개의 무작위 뉴클레오타이드를 가지는 라이브러리를 멤브레인 컬럼 튜브에서 H5N1과 반응 시켜 결합을 유도하였다. H5N1 표면에 결합된 DNA는 멤브레인 컬럼 위에 존재하고, 결합되지 않은 DNA는 멤브레인을 통과해 컬럼 아래로 용출된다. 이를 이용하여 원심분리를 통해 H5N1에 결합하는 DNA와 결합하지 않은 DNA를 분리하였다. 멤브레인 컬럼 위에 존재하는 H5N1과 결합한 DNA만 용출하여 증폭 시킨 후 다음 라운드에 SELEX에 사용하였다. 점점 높은 농도의 결합 완충용액과 적은 반응 시간을 가지는 6 라운드의 SELEX와 H5N1에 결합 특이성을 높이기 위하여 1 라운드는 BSA를 목표 물질로 Negative SELEX를 수행하였다. 최종 7 라운드의 SELEX를 통해 H5N1과의 강한 결합력과 낮은 검출 한계를 가지는 60-mer 길이의 DNA 압타머를 개발하였다. 이 압타머는 또한 다른 하위 유형을 가지는 조류독감 바이러스 (H1N1, H5N6, H9N2)에 대해서 특이도를 가지는 것을 확인했다. 또한 조류독감 바이러스 표면에 존재하는 Hemagglutinin 단백질의 적혈구를 응집하는 능력을 저해하는 것을 확인했다. 본 연구를 통해 개발된 압타머는 고병원성 조류독감 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 압타머로서, 축산 농가에서의 조류독감 진단 체계와 새로운 유형의 항 바이러스제로서 조류독감 치료제에 응용이 가능할 것으로 기대된다.
Avian influenza has severely affected the poultry industry worldwide, resulting in the deaths of millions of birds. The highly pathogenic avian influenza virus is characterized by high mortality and the ability to transfer from birds to humans. Early diagnosis is difficult because of the variation in the pathogenicity and the genetic diversity of each virus subtype. Therefore, development of a sensitive and accurate diagnostic system is of utmost priority. We developed single-stranded aptamer for Avian influneza diagnosis. Through seven rounds of systematic evolution of ligands by exponential enrichment towards one of the highly pathogenic subtypes of the virus (H5N1), we identified 16 aptamer sequences and selected two of them based on frequency. The two selected aptamers showed strong binding affinities and low detection limits. We found that they could differentiate the H5N1 virus from other subtypes. Furthermore, our screened aptamer inhibited hemagglutination, caused by hemagglutinin, the surface protein of the avian influenza virus. Our results show that these H5N1 virus-specific aptamers work well as molecular probes for the diagnosis of H5N1 and are expected to be used as therapeutic agents that inhibit the viral surface proteins. Sensitive diagnosis or suppression of avian influenza will help stand the livestock industry and human health in good stead.
URI
https://repository.hanyang.ac.kr/handle/20.500.11754/99852http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000434445
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