Megasphaera hexanoica의 Leucine 대사 경로를 통한 Isovaleric Acid의 생산 최적화 연구

Abstract

급격한 기후 변화와 석유 자원의 고갈에 대한 우려로 인해 신재생 에너지에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 미생물 공정을 이용한 바이오 에너지 생산은 효율적이고 지속 가능한 대체 에너지 생산방법이며, 특히 혐기성 미생물의 발효를 통해 바이오연료와 화학제품으로 사용가능한 유기산을 생산할 수 있다. 유기산은 탄소 개수와 사슬 형태에 따라 활용처와 가치가 달라지며 이 중 isovaleric acid(i-VA)는 branched short-chain carboxylic acids(b-SCCAs)의 일종으로 바이오연료뿐 아니라 의약품 및 향료로 사용 가능하여 산업적 가치가 높은 물질이다.

이에 본 연구에서는 뛰어난 caproic acid 생산 능력을 보유한 것으로 알려진 Megasphaera hexanoica를 이용하여 isovaleric acid를 생산하였다. isovaleric acid 생산에 영향을 미치는 주요 인자는 yeast extract, leucine, sodium acetate의 농도이며, 반응표면분석법 중 central composite design(CCD) 모델을 사용하여 isovaleric acid 생산량을 최적화하였다. 제안된 최적 배지 조성은 yeast extract 19.64 g/L, leucine 19.68 g/L, sodium acetate 9.55 g/L, K2HPO4 2 g/L, fructose 20 g/L, salt solution 40 mL/L, cysteine-HCl·H2O 0.5 g/L이다. 실제 실험을 통해 생산된 isovaleric acid의 양은 63.5 mM로 반응표면분석을 통해 예상된 결과값인 63.3 mM과 일치하는 결과이며, isovaleric acid 생산 최적화가 적합한 방법으로 수행되었음을 확인하였다.

또한, 배지 내 leucine 첨가 유무에 따라 M. hexanoica의 성장과 isovaleric acid 생산성을 비교하였다. Leucine을 첨가하였을 때, 미생물 성장 속도는 증가하였고 isovaleric acid의 생산량과 전체 유기산 생산량도 향상되었다. 이를 통해 leucine이 미생물 내 단백질 합성에 도움을 주며 isovaleric acid 생산의 전구물질로 사용되는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 leucine을 포함한 11종의 아미노산을 각각 첨가하여 M. hexanoica의 성장과 isovaleric acid 생산성 향상에 도움이 되는 아미노산 종류를 조사하였다. Branched-chain amino acids를 통해 branched-chain carboxylic acids가 합성되고 특히 methionine과 threonine을 첨가한 경우에는 odd numbered carbon-chain carboxylic acids가 생산되었다. Serine은 에너지원으로 사용되어 미생물의 성장에 도움을 주며, leucine을 첨가한 조건에서는 유기산 생산성이 탁월하게 향상되는 것이 관찰되어 b-SCCAs의 생산을 위해 산업적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.; Research is being conducted actively in the field of renewable energy due to concerns about rapid climate change and depletion of petroleum resources. Bio-energy production using microbial processes is an efficient and sustainable alternative energy, which means production of caboxylic acids through fermentation of anaerobic microorganisms. Carboxylic acids can be classified according to the number and type of carbon chains, of which isovaleric acids(i-VA) is a type of branched short-chain carboxylic acids(b-SCCAs) that can be used as a pharmaceutical, fragrance and fuel, which is of high industrial value.

In this study, isovaleric acid was produced using Megasphaera hexanoica, which is known to have excellent caproic acid production capacity. The central composite design(CCD) model of response surface methodology(RSM) was used to optimize isovaleric acid production. The key factors for optimum medium are yeast extract, leucine and sodium acetate. The composition of proposed optimal medium is as follows: yeast extract 19.64 g/L, leucine 19.68 g/L, sodium acetate 9.55 g/L, K2HPO4 2 g/L, fructose 20 g/L, salt solution 40 mL/L, cysteine-HCl·H2O 0.5 g/L. The amount of isovaleric acid produced in the actual experiment was 63.5 mM, which is equivalent to 63.3 mM, the result expected by RSM, so that isovaleric acid production optimization was performed suitably.

I also investigated the growth and productivity of M. hexanoica to see how much production of isovaleric acid has increased with or without of leucine in the medium. When leucine was added, the maximum O.D. and the productivity of isovaleric acid and total acids were increased. It is indicated that leucine could be used as a precursor of isovaleric acid and helped to synthesizing proteins. In addition, 11 amino acids, including leucine, were added respectively to identify amino acids which play an important role in increasing the growth and productivity. Branched-chain amino acids(BCAAs; valine, leucine, isoleucine) produced branched-chain carboxylic acids(BCCAs; isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutanoic acid) and methionine and threonine produced odd numbered carbon-chain carboxylic acids(OCCAs; propionic acid, valeric acid). Serine is used as an energy source to help in the growth and leucine exhibits high acid productivity, which has advantages in industrial application.