Altered Expression of Renal Claudins in Rats with Metabolic Acidosis and Hypercalciuria

Abstract

연구 배경: 체내 칼슘 항상성은 위장관 흡수, 뼈 대사 및 신장 배설을 통해 유지되므로, 사구체에서 칼슘 여과 후 이루어지는 세관 이동이 중요하다. 대사성 산증에서 동반하는 고칼슘뇨증은 신세관의 칼슘 재흡수 억제에 의할 가능성이 높은데, 칼슘 재흡수를 능동적으로 조절하는 부위인 원위곡세관에서 칼슘통로 TRPV5의 역할이 알려졌다. 한편, 사구체에서 여과된 칼슘 재흡수의 대부분은 근위세관과 헨레고리 비후상행각에서 수동적으로 세포사이 이동에 의해 이루어진다. 최근 연구결과, 대사성 산증에 의한 고칼슘뇨증 발생에 있어서 근위세관에 분포하는 클로딘-2 밀착연결단백의 발현 저하가 관여한다고 보고되었다. 그러나 헨레고리의 비후상행각에서 칼슘 이동을 수동적으로 매개하는 여러 클로딘 및 cacium-sensing receptor(CaSR)와 같은 칼슘의 수동적 흡수 관련 단백의 역할에 대해서는 아직 조명된 바 없다. 이에 본 연구자는 대사성 산증으로 유도된 고칼슘뇨증 동물 모델과 산성 배지를 이용한 세포 실험을 통해서 신장에 발현하는 여러 클로딘 및 CaSR 발현의 변화를 조사함으로써 그 역할을 규명하고자 하였다. 연구 방법: 체중 180~200g인 웅성 Sprague-Dawley rat을 대조군(n=6)과 실험군(n=6)으로 무작위 배정하였다. 실험군에서는 염화암모늄(NH4Cl)을 체중 220g 당 7.2 mmol 되도록 slurry 사료에 혼합하여 1주일 동안 매일 공급함으로써 대사성 산증을 유도하였다. 대조군에서는 염화암모늄을 제외한 같은 성분의 사료를 실험군과 동일하게 공급하였다. 동물실험 종료 시에 혈액과 요 검체를 수집하였고, 신장을 획득하여 그 조직으로부터 immunoblot 분석, quantitative PCR 분석 및 면역형광 현미경을 통해 여러 클로딘 및 CaSR 발현 변화를 조사하였다. 이와 더불어 HK-2와 MDCK I 세포을 이용한 세포 실험을 통해서 산성 pH가 여러 클로딘 발현에 영향을 미치는지 여부에 대해서 조사하였다. 연구 결과: 대조군에 비하여, 요 pH가 실험군에서 유의하게 낮았다(5.17 ± 0.06 vs. 6.79 ± 0.08, P = 0.004). 24시간 요 칼슘 배설(16.40 ± 6.31 vs. 5.12 ± 3.58 mg/d/100 g BW, P = 0.01) 과 칼슘 분획 배설률(0.90 ± 0.36 vs. 0.27 ± 0.12 %, P = 0.004)은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 증가하였다. 근위세관에 분포하는 클로딘-2 단백 발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 낮았다(85 ± 91 vs. 00 ± 11 %, P < 0.05). 클로딘-2 mRNA 발현 역시 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 낮았다(49 ± 23 vs. 100 ± 17 %, P < 0.05). 한편, 헨레고리 비후상행각에 분포하는 클로딘-16(85 ±9 vs.100 ± 11 %, P < 0.05)과 클로딘-19(76 ± 6 vs. 100 ± 7 %, P < 0.05) 단백 발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 낮았다. 반면에 클로딘-14(214 ± 71 vs. 100 ± 14 %, P < 0.05) 과 CaSR (164 ± 7 vs. 100 ± 27 %, P < 0.05) 단백 발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 높았다. 클로딘-16과 클로딘-19 및 클로딘-14와 CaSR mRNA 발현도 두 군간의 단백 발현 변화의 양상과 각각 일치하였다. 클로딘-7단백발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 낮았으나(67 ± 16 vs. 100 ± 33 %, P < 0.05), 클로딘-8 단백발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 높았다(135 ± 2 vs. 100 ± 8 %, P < 0.05). 클로딘-4와 클로딘-10 단백발현은 두 군간에 유의한 차이가 없었다. 클로딘-4(157 ± 26 vs. 100 ± 43 %, P < 0.05) 과 클로딘-7(133 ± 19 vs. 100 ± 16 %, P < 0.05) 및 클로딘-8(125 ± 15 vs. 100 ± 20 %, P < 0.05) mRNA 발현은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 높았으나, 클로딘-10 mRNA 발현은 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 세포실험 결과, pH 6.0, pH 6.4, 그리고 pH 6.8인 배지에서 12시간과 24시간 동안 배양된 HK-2세포의 경우가 pH 7.4 배지에서 배양된 세포의 경우보다 클로딘-2의 단백발현이 감소하였다. 반면에 pH 6.0, pH 6.4, pH 6.8, 그리고 pH 7.2인 배지에서 24시간 동안 배양된 MDCK I세포의 경우가 pH 7.4 배지에서 배양된 세포의 경우보다 클로딘-8의 단백발현이 증가하였다. 결론: 대사성 산증 동물모델에서 고칼슘뇨증이 유도되었고 근위세관 클로딘-2 발현 뿐만 아니라, 비후상행각 클로딘-16 및 클로딘-19발현 감소와 클로딘-14 및 CaSR 발현 증가를 확인하였다. 한편, 요중 칼슘 분비와 집합관 클로딘-8의 연관성에 대해서는 분명하지 않지만, 대사성 산증과 클로딘-8 발현 증가 사이의 연관성이 있음을 보여 주었다. 요컨대, 대사성 산증에서 헨레고리 비후상행각의 클로딘-16 및 클로딘-19 발현 저하와 클로딘-14 및 CaSR 발현 증가가 고칼슘뇨증 발생에 기여한다는 새로운 소견을 보고하는 바이다.