Role of the cytoplasmic domain of CTLA-4 in regulatory T cell conversion to inhibit autoimmunity

Abstract

자가면역반응은 자가항원에 대한 면역관용이 정상적으로 작동하지 않을 때 발생되며, 심각한 자가면역 질환을 유발한다. 자가항원에 대한 반응성이 있는 T세포 클론을 제거하는 중추면역관용을 벗어나거나, 조절 T세포에 의한 말초면역관용이 정상적으로 작용하지 않을 때, T세포에 의한 자가면역질환이 발생하게 된다. 따라서, 건강한 환경에서 조절 T세포의 반응은 면역항상성 유지에 매우 중요하며 또한, T세포 반응은 면역관문 단백질에 의해 조절되고 있다. 가장 중요한 면역관문 단백질 중 하나인 Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4 (CTLA-4)는 T 세포의 표면에 발현되며 항원표지세포의 B7과 결합하여 T세포의 활성화 신호를 차단할 수 있고, 음성신호전달을 매개할 수 있다. B7 단백질과의 결합 외에도 리간드 독립적 CTLA-4 (liCTLA-4, 세포밖 도메인이 결여된 선택적 스플라이싱)가 T세포의 활성화 및 면역반응을 조절 할 수 있으며, 세포투과펩타이드와 연결된 CTLA-4의 세포질 도메인(ctCTLA-4)을 이용한 T세포 반응 억제 및 알레르기성 염증반응 억제가 보고된 바 있다. 또한 CTLA-4는 조절 T세포의 면역억제기전에 중요한 역할을 하며 동시에 Foxp3의 발현 및 조절 T세포의 분화에 CTLA-4 신호전달이 필요함이 밝혀졌다. 이는 CTLA-4의 세포질 도메인 및 신호전달이 말초면역관용의 정상적인 유지에 필수적임을 시사한다. 자가면역질환을 치료하기 위해 조절 T세포를 이용하거나 조절 T세포를 증진시키는 것은 매우 중요한 전략으로 여겨지고 있으나 현재까지의 시도에서는 성공적인 사례가 없었다. CTLA-4의 세포밖 도메인을 이용한 CTLA4-Ig역시 임상에 사용되고 있지만 조절 T세포의 증진과는 상관관계가 없는 것으로 알려져있다. 이에 본 연구에서는 재조합 단백질 형태로써 ctCTLA-4를 이용해 조절 T세포를 증진시키고 말초면역관용이 회복되는지에 대한 연구를 수행하였으며, 이를 통해 자가면역질환 및 T세포 매개 면역질환의 개선이 가능한지를 확인하였다. 첫째로, 본 연구에서는 ctCTLA-4를 T세포의 세포질 안으로 전달하기 위하여 인간 단백질로부터 유래한 세포 투과펩타이드를 동정하였다. dNP2라 명명한 이 펩타이드는 카고 단백질을 in vitro, in vivo상에서 면역세포로 매우 높은 효율로 전달하였으며 염증이 유발된 중추신경계내에 유입된 T세포 내로도 전달할 수 있는 것을 확인하였다. 또한 dNP2는 비강점막을 통해 주입하였을 때에 호흡계 장기내로 단백질을 전달할 수 있음을 규명하였다. 마우스 시스템에서 규명한 위와 같은 효과 외에도, dNP2는 고분자물질의 도입 및 이를 통한 활성조절이 매우 어렵다고 알려져있는 인간 T세포 내로도 단백질을 매우 높은 효율로 전달하는 것을 규명하였다. 이러한 dNP2의 높은 단백질 전달 효능을 이용하여, dNP2-ctCTLA-4재조합 단백질을 개발 및 생산하였다. 이는 T세포의 활성을 효과적으로 억제할 수 있었고, 다발성 경화증 동물 모델에서 Th1 과 Th17 면역반응을 저해함으로써 질환을 억제할 수 있음을 규명하였다. 또한 dNP2-ctCTLA-4는 Th2면역반응을 저해함으로써 호흡계에서 발생하는 알레르기성 기도 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다. 즉, CTLA-4의 세포질 도메인만으로도 자가면역질환 및 알레르기성 질환을 억제할 수 있음을 규명한 것이다. 뿐만 아니라, 인간의 면역체계를 갖는 인간화 생쥐를 이용한 in vivo 동종이식거부반응 모델에서도 dNP2-ctCTLA-4는 인간 T세포 에의한 피부이식 거부 및 모세혈관이식 거부 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 규명하였다. 본 연구에서는 또한 CTLA-4의 세포질 도메인이 T세포의 기능을 조절하는 새로운 분자적 기전을 규명하였는데, 이는 TGF-β가 존재하는 환경에서 T세포가 활성화 되거나 effector T세포로 분화되는 것을 조절 T세포의 주요 전사인자인 Foxp3를 발현하는 세포로 변환시킨 다는 것이다. ctCTLA-4는 프롤린 모티프를 통한 Jak2 및 라이신 모티프를 통한 PKC-η와 결합할 수 있으며 이를 통해 TGF-β신호 전달을 강화하며 동시에 IL-6와 같은 염증성 사이토카인 신호전달을 억제함으로써 Foxp3의 발현을 촉진할 수 있음을 확인하였다. 게다가 단순히 Foxp3의 발현만을 촉진하는 것이 아니라 mRNA프로파일을 분화된 조절 T세포 (iTreg)와 유사하게 변환시키고, 변환 된 세포는 면역 억제 기능을 갖는 다는 것을 규명하였다. 결론적으로 본 연구는, CTLA-4의 세포질 도메인을 재조합 단백질 형태로 T세포 내로 전달하는 기술을 개발하였고 이를 이용한 T세포 매개 자가면역질환, 알레르기성 질환, 동종이식거부반응 치료효능을 규명하였다. 특히, CTLA-4의 세포질 도메인이 조절 T세포의 변환을 유도하는 기능과, 그 분자적 기전을 규명하였다. 이를 이용한 후속 연구를 통해 환자의 면역관용을 증가시킴으로써 자가면역질환을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.; Autoimmunity is induced by breakdown of immune tolerance to self antigen and results severe autoimmune diseases. In the development of autoimmunity, T cell has crucial roles by escaping central tolerance and abnormally regulating regulatory T (Treg) cell-mediate peripheral tolerance. In healthy condition, T cell responses are tightly regulated through various immune checkpoint proteins. One of the major immune checkpoint protein, Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4 (CTLA-4) on T cell surface, interacts with B7 molecules on the antigen presenting cells (APC). CTLA-4 blocks CD28-B7 interaction-mediated co-stimulatory signal and transduce negative signaling for T cell activation. Besides the interaction with B7 molecules, a few studies reported that ligand independent CTLA-4 (liCTLA-4, lacking extracellular domain by alternative splicing) also can regulate T cell responses and purified cell-permeable cytoplasmic domain of CTLA-4 (ctCTLA-4) inhibited T cell responses and allergic inflammation previously. Although these findings demonstrate together the importance of the ctCTLA-4 in regulation of T cell responses, its extracellular domain only has been clinically used by fusing with fragment crystallizable (Fc) region of human immunoglobulin G (CTLA4-Ig). In autoimmune diseases, utilizing Treg cells and inducing Treg cells to provide immune tolerance to patients is one of the most hopeful strategy, but previous attempts including CTLA4-Ig could not provide successful outcomes. Here, we used the ctCTLA-4 as a recombinant protein to treat autoimmune disease based on importance of CTLA-4 in regulatory T cell function and promoting Foxp3 expression. Firstly, this study identified a novel, human protein derived cell-permeable peptides to deliver ctCTLA-4 into the cytoplasm of the T cells. dNP2-peptide efficiently delivered protein cargo into the primary immune cells in vitro and in vivo, and into the T cells in inflamed central nervous system (CNS) by penetrating blood-brain barrier. It also delivered its cargo protein into mouse respiratory tracts across airway epithelial barrier. It was also demonstrated that dNP2 could efficiently deliver cargo protein into primary human T cells, which is one of the most difficult cells to modulate. Based on this high efficient protein delivery ability of dNP2, dNP2-ctCTLA-4 was cloned and purified as recombinant protein. The protein inhibited T cell activation in vitro and inhibited mouse autoimmune encephalomyelitis with significantly lowered infiltration of Th1 and Th17 cells in the CNS. In addition, the dNP2-ctCTLA-4 protein delivery also inhibited mouse allergic airway inflammation with decreased Th2 responses suggesting only cytoplasmic domain of CTLA-4, without its ligand association, can inhibit various mouse T cell-mediated autoimmune and allergic diseases. In addition, it also significantly inhibited skin and microvessel allograft rejection in humanized mice system via inhibition of T cell response, suggesting that it could regulate human T cell responses in vivo. Importantly, as its novel suggested mechanism in T cell functions, dNP2-ctCTLA-4 could convert naïve or effector T cells to Foxp3 expressing T cells in the presence of TGF-β. It binds to Jak2 and PKC-η through its proline and lysine residues, and respectively enhances TGF-β signaling simultaneously with the inhibition of IL-6 signaling, sufficiently to promote Foxp3 expression. Moreover, it was confirmed that dNP2-ctCTLA-4 also convert mRNA profiles to resemble with induced Treg cells and the converted cells have suppressive functions. Collectively, these findings suggest that the cytoplasmic domain of CTLA-4 can convert effector T cells to Treg cells and provide a novel strategy to fundamentally cure autoimmune diseases by enhancing patient’s own immune tolerance. Also the findings elucidate a precise signaling mechanism of the cytoplasmic domain of CTLA-4 in Treg cell conversion.