신규 타겟 기반 항 결핵제 개발 및 이의 메커니즘 분석 연구

Abstract

결핵은 단일 감염병으로 세계 3번째로 많은 사망자를 유발하는 병이다. 이러한 결핵은 다양한 결핵치료제의 개발을 통해 치료가 가능하나, 기존 약물의 경우 6개월 이상의 치료기간이 필요하다. 또한, 이러한 약물에 대한 내성의 발생으로 인해 이를 극복하기 위한 새로운 타겟 기반의 저해제 개발이 시급한 상황이다. 에큐마이신은 신규 타겟으로써 caseinolytic protease C1 (ClpC1)을 가지는 결핵균에 대한 강력한 저해제이다. 이러한 에큐마이신의 ClpC1에 대한 반응 기전을 확인하였다. 이를 위해 에큐마이신 결합자리에 대한 자리지정 돌연변이 연구를 실시했다. 먼저, 분자 도킹을 이용하여 에큐마이신의 결합자리를 규명한 후, 선택된 잔기의 자리지정 돌연변이를 구축하여, 에큐마이신 결합에 대한 영향을 확인했다. 그 중, R83잔기의 돌연변이는 ClpC1에 대한 에큐마이신의 ATP 분해활성 촉진과 단백질 분해 활성 저해에 대한 저항성을 가졌으며, 특히 R83A의 경우 활성이 거의 사라지는 것을 확인했다. 이를 통해, 에큐마이신의 결합에 R83이 강하게 연관 되어 있음을 확인 하였다. 또한, 이러한 잔기가 ClpC의 접합 단백질인 MecA와 같은 결합자리임을 확인하여, 에큐마이신이 MecA와 유사한 효과를 나타냄을 확인했다. 이러한 에큐마이신은 결핵균에 대한 저해효과는 강하지만, 에큐마이신의 물에 대한 낮은 용해도는 이 저해제의 구강복용을 불가능하게 만든다. 에큐마이신의 용해도를 높이기 위해 이 실험에서는 수용성의 ClpC1 binding peptide (CBP)를 에큐마이신에 연결하였다. 이 CBP는 페이지 디스플레이라는 방법을 통해 발굴되었고, diepoxy butane응 이용 이스터 본드를 형성하며 에큐마이신에 연결되었다. 이렇게 합성된 에큐마이신 유도체는 MTB ClpC1과 ClpC1, ClpP1/P2 복합체에 대한 에큐마이신과 유사한 효과를 나타냈다. 또한, 물에 대한 높은 용해도를 나타냈으며, MTB H37Rv 균주에 대한 강한 저해효과를 나타냈다. 이러한 결과는 새롭게 개발된 에큐마이신 유도체가 구강투여를 통한 신규 결핵치료제로써 활용가능함은 보였다. 마지막으로, 결핵균의 새로운 저해 타겟으로 사용될 수 있는 AHAS의 저해 기전을 분석했다. AHAS는 BCAA의 합성에 관여하는 효소로 신규 항생 물질 탐색의 타겟으로 제안되고 있는 단백질이다. 이러한 AHAS의 제초제 결합자리를 규명하여, 자리지정 돌연변이 분석을 통해 저해 기전을 규명했다. 다양한 잔기 중, R318 잔기의 경우 돌연변이 발생 시 AHAS 활성이 없어짐을 확인했다. 또한, chlorimuron ethyl (CE)에 대한 저해효과를 규명 시 선택된 잔기의 돌연변이가 저항성을 나타냄을 확인했다. 종합하여, 선택된 잔기가 CE의 결합에 중요한 역할을 하며, R318의 경우 활성에 있어서도 중요한 역할을 함을 확인하였다. 이를 통해, MTB AHAS 또한 AHAS를 타겟으로 하는 제초제의 사용과 같이 이를 타겟으로 하는 저해제 개발을 통해 결해균의 효과적인 저해가 가능함을 확인했다.; TB, caused by Mycobacterium tuberculosis, is the third greatest killer as a single infectious agent. TB is a curable disease by treatment with a multiple-drug regimen administered by directly observed therapy for 6 months or more. However, the emergence of MDR or XDR-TB leads to significant decrease of efficiency of conventional drugs and requirement of development of a novel drug for TB. Ecumicin is a potent inhibitor against Mycobacterium tuberculosis (MTB) targeting caseinolytic protease C1 (ClpC1) as a novel target.although the target of Ecumicin is caseinolytic protease C1 (ClpC1), the exact mechanism by which Ecumicin inhibitsClpC1 has not been identified. To analyze Ecumicin’s action on ClpC1, site-directed mutagenesis was performed on its binding site. The estimated binding residues within ClpC1 to Ecumicin were selected via in silico analysis using molecular docking. The selected residues were mutated by site-directed mutagenesis and the effects on Ecumicin binding were analyzed. Mutation at the R83 residue, especially the R83A mutation, in ClpC1 resulted in strong resistance to ATPase activation and inhibition of proteolytic activity. These results reveal that the R83 residue plays an important role in the binding of Ecumicin. Secondly. the low solubility of Ecumicin in water leads the challenge to be applied for treatment of tuberculosis (TB) via oral administration. Therefore, in order to increase the solubility, we incorporated the ClpC1 binding peptide (CBP) to Ecumicin. The CBPs were identified by a method known as phage display and the peptides were linked with Ecumicin using diepoxy butane as a linker forming ester bond. The Ecumicin derivatives exhibited similar activity against MTB ClpC1 or ClpC1 and ClpP1/P2 complex with Ecumicin. Furthermore, the derivatives showed high solubility in water and inhibition against MTB H37Rv strain. The results suggested that the derivatives could be used as a novel TB drug administrated through oral. Lastly, MTB AHAS has been proposed to be an essential target for novel antibacterial agents. Therefore, I investigated the roles of multiple conserved herbicide-binding site residues in MTB AHAS through site-directed mutagenesis. Importantly, mutation of R318 led to a complete loss of AHAS activity. Furthermore, all mutants demonstrated significant herbicide resistance against chlorimuron ethyl (CE). Taken together, these data suggest that the residues examined here mediate CE binding and may also be important for the catalytic activity of AHAS. This study will pave the way for future studies of CE and will also aid the development of novel anti-tuberculosis agents.