자몽종자추출물 함유 나노 입자의 최적화 및 구강 항균 활성 증진

Abstract

일반적으로 충치로 알려져 있는 치아우식증은 인간을 괴롭히는 가장 일반적인 전염병 중 하나로, Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus가 주요한 원인 균으로 지목되었다. 이러한 구강균의 성장을 억제하기 위해 불소 화합물과 클로르헥시딘 같은 화학 물질들이 주로 사용되어왔으나, 구강 점막의 박리 혹은 통증, 치아 변색, 복통 등의 부작용이 보고되고 있어 최근 천연 항균 물질에 대한 연구가 증가하고 있다. 특히 자몽종자추출물은 구강 균에 대한 항균 활성이 보고된 바 있으나, 화학 물질에 비하여 항균 활성이 약하고, 난용성으로 식품이나 제약 산업으로의 이용에 제한이 있다. 따라서 본 연구는 캡슐화를 통하여 이러한 자몽종자추출물의 단점을 개선하고, 항균 활성을 증진시키고자 하였다. 특히 캡슐화의 피복소재로써 항균 활성을 가지는 것으로 알려진 키토산과 도데실황산나트륨을 이용하여 캐리어 그 자체만으로도 항균 활성을 가지는 나노입자를 제조하고자 하였다. 불용성 키토산과 수용성 키토산을 이용한 나노입자를 제조하여 항균 활성을 비교한 결과, 두 종류의 키토산으로 제조된 나노입자의 최소저해농도는 입자 크기나 키토산의 종류에 관계 없이 모두 같았다. 그러나 수용성 키토산으로 제조된 나노입자가 불용성 키토산으로 제조된 나노입자에 비하여 재분산성이 우수하여, 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자의 피복 물질로 선정되었다. 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자는 입자 크기 300 nm 에서 600 nm 의 다섯 가지 크기로 제조되었다. 다섯 가지 크기의 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자는 캡슐화 되지 않은 자몽종자추출물에 비하여 S. mutans에 대한 항균 활성이 우수한 것으로 확인되었으며, 특히 time-kill 연구에서 입자 크기가 가장 작은 300 nm의 나노입자의 항균 활성이 가장 우수함이 확인되었다. 캡슐화에 의한 항균 활성의 차이를 명확히 하기 위하여 자몽종자추출물의 농도를 높이고자 하였으나, 나노입자의 침전이 발생하였다. 따라서 반응표면분석법을 이용하여 입자 특성이 우수하면서 충분한 양의 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자를 제조하고자 하였다. 독립 변수로서 수용성 키토산과 도데실황산나트륨의 농도를 선정하였으며, 최적 조건으로 키토산 0.45 mg/mL과 도데실황산나트륨 0.30 mg/mL이 선정되었다. 최적화된 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자는 캡슐화 되지 않은 자몽종자추출물에 비하여 물에 대한 용해도가 2배 이상 높았으며, S. mutans와 S. sobrinus에 대한 항균 활성 역시 피복 물질과의 상승 효과를 통하여 증가되었다. 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자의 항균 기전을 이해하고자 시차주사현미경을 이용하여 형태학적 특성을 관찰하였다. 자몽종자추출물이 포집 된 나노입자는 대조군과 비교하여 세포막 손상에 의한 세포 내 물질의 유출이 확인되었다. 따라서 키토산과 도데실황산나트륨 을 이용한 나노입자는 그 자체가 항균 활성을 가지는 나노입자로 확인되었으며, 자몽종자추출물과 같은 천연 항균 물질을 포집함으로써 구강질환의 원인 균에 대한 자몽종자추출물의 항균 활성과 물리적 특성을 개선시킬 수 있는 효과적인 나노전달체이자 천연 구강 항균제로의 이용 가능성을 확인하였다.; The aim of this study was to develop antimicrobial nanoparticles (NPs) using chitosan (CS) and sodium dodecyl sulfate (SDS) as wall materials and to prove the influence of particle size on the antimicrobial activity against oral bacteria. Water-insoluble chitosan (WIC), water-soluble chitosan (WSC), and SDS were selected as the wall materials to provide antimicrobial activity for NPs. After WIC NPs and WSC NPs were prepared in different sizes ranging from 300 to 600 nm, their characteristics were compared. With respect to minimum inhibitory concentrations (MICs), there were no differences in the MICs of any CS/SDS NPs, indicating that WIC NPs and WSC NPs can be used as antimicrobial carriers. In terms of redispersibility, the WSC NPs were more stable than the WIC NPs after drying, therefore WSC NPs were selected as the antimicrobial carriers for grapefruit seed extract (GSE) encapsulation. The physically stable GSE-loaded NPs (GNPs) were prepared in different sizes (300-600 nm) to analyze their antimicrobial activity. The MICs of all GNPs against Streptococcus mutans were three times lower than those of free GSE were. In the time-kill assays, GNPs with 300 nm diameters showed the significantly highest antimicrobial activity among all samples (p<0.05). Thus, this study demonstrates the great potential of WSC/SDS NPs as antimicrobial carriers against oral bacteria. Response surface methodology (RSM) was used to optimize the preparation conditions for grapefruit seed extract (GSE)-loaded nanoparticles (NPs) by minimizing particle size while maintaining particle quality. Independent variables included water-soluble chitosan (WSC, X1, mg/mL) and sodium dodecyl sulfate (SDS, X2, mg/mL) concentrations. The optimized values of X1 and X2 were found to be 0.45 and 0.30 mg/mL, respectively. The solubility of optimized GSE NPs was at least two-fold higher relative to non-nanoencapsulated counterparts. The MIC of GSE NPs was about 10-fold lower than that of free GSE, and equal in value to blank NPs. In addition, time-kill assays showed that antimicrobial activity of GSE NPs was significantly higher than blank NPs and free GSE due to nanoencapsulation synergy effects (p<0.05). By SEM, it was visually observed that GSE NPs damaged the bacterial cell membrane. Therefore, WSC/SDS nanoencapsulation with WSC/SDS is a potentially useful technique for improving the solubility and oral antimicrobial activity of GSE.