폴리감마글루탐산에 의한 파골세포의 분화 조절

Abstract

류마티스관절염은 염증성 관절질환으로, 만성 염증과 염증에 의한 뼈 파괴가 주요 특징이다. 특히 뼈를 흡수하는 파골세포는 류마티스관절염의 뼈 파괴 기전에서 염증세포들과 함께 중요한 역할을 하는 세포로 알려져 있다. 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)은 Bacillus subtilis에서 유래된 고분자 물질로 천식 동물모델에서 Th17 세포 분화 억제를 통해 알레르기성 기관지염을 감소시키는 항염증 효과가 보고되었다. 하지만 류마티스관절염의 파골세포 분화과정에서 γ-PGA의 효과는 아직 연구 된 바가 없다. 따라서 본 연구는 사람과 마우스에서 γ-PGA가 뼈 파괴의 주요세포인 파골세포 분화를 조절하고 관절 손상을 예방 할 수 있는지 조사하였다. 파골세포분화과정에서 γ-PGA의 효과를 확인하기 위해, 정상인의 혈액과 류마티스관절염 환자의 활액에서 유래한 파골전구세포, 그리고 마우스 골수 유래 파골전구세포에서 γ-PGA투여 효과를 관찰하였다. 파골세포 분화는 TRAP 양성인 다핵세포 수를 평가하고 actin ring 형성 유무를 확인하였다. 또한 파골세포 분화 관련 유전자와 단백질의 발현 변화를 조사하였다. 기존 선행 연구들에 따르면 γ-PGA가 Toll-like Receptor 4 (TLR4)를 통해 작용한다는 보고가 있어, TLR4 결핍 마우스에서 γ-PGA와 TLR4 리간드(ligand)인 LPS를 처리하여 대조군 마우스와 비교하였다. in vivo에서도 γ-PGA의 효과를 확인하기 위하여 관절염 유도 마우스에서 γ-PGA 투여 시, 파골세포형성 및 관절파괴가 억제되는지 관찰하였다. 그 결과, 정상인 혈액과 류마티스관절염 환자 활액에서 유래한 파골전구세포에서 γ-PGA에 의해 파골세포 형성이 완전히 억제되었다. 또한 TRAP, cathepsin K, DC-STAMP, ATP6v0d2 같은 파골세포 특이 유전자도 유의하게 감소하였다. RANK 발현은 mRNA와 단백질 수준에서 모두 유의하게 감소하였고, RANK 발현을 유도하는 M-CSF 수용체 단백질이 γ-PGA 자극에 의해 부분적으로 감소되었다. in vitro 실험의 대조군 마우스에서도 γ-PGA에 의해 파골세포 형성이 완전히 억제되었다. 하지만 사람에서와는 달리 TRAP, CTK 등과 같은 파골세포 특이적 유전자들은 유의한 변화가 없었다. 또한 TLR4 결핍 마우스에서도 γ-PGA의 파골세포 분화 억제 작용이 관찰 되어, 마우스 파골세포에서 γ-PGA의 작용이 TLR4를 통해 일어나지 않음을 확인하였다. 마지막으로 CIA 관절염 유도 마우스에 γ-PGA 투여 시, 관절 조직 내의 파골세포 감소와 현저한 관절손상 억제가 관찰되었으며, 염증성 사이토카인인 IL-1β, TNF-α가 유의하게 감소됨을 확인하였다. 종합해보면, 본 실험을 통해 사람과 마우스에서 γ-PGA에 의해 파골세포 분화가 현저히 억제됨 관찰하였고, 관절염 유도 마우스 모델에서 γ-PGA가 파골세포형성, 관절 손상 및 염증성 사이토카인을 억제함을 확인하였다. 따라서 본 연구의 결과는 γ-PGA가 류마티스관절염 같은 염증성 뼈 파괴 질환에서 뼈 파괴 억제 치료에 활용될 수 있는 새로운 치료 후보 물질로서 가능성을 제시 할 것으로 생각된다.; Background/Purpose: Rheumatoid arthritis (RA) is an inflammatory disease that is characterized by chronic inflammation and bone destruction. Osteoclasts, which are bone-resorbing cells, are generally known to play a pivotal role in the pathogenesis of bone destruction in RA. Poly–γ-glutamic acid (γ-PGA), a natural polymer derived from Bacillus subtilis, has anti-inflammatory activity. It is mediated by suppressing differentiation of Th17 cells in asthma model. However, the effects of γ-PGA in RA osteoclast differentiation is unclear. Therefore, we evaluated whether γ-PGA prevents inflammation and joint damage of RA by regulating osteoclast differentiation in human and mice. Methods: We tested the inhibitory effect of γ-PGA on osteoclastogenesis in healthy human peripheral blood monocytes, RA synovial fluid macrophages, and mouse bone-marrow-derived macrophages (BMMs). The osteoclastogenesis was assessed by generation of TRAP-positive multinucleated cells and actin ring formation. We analyzed the expressions of essential genes and proteins for osteoclast differentiation by real-time PCR and western blot analysis. We observed whether treatment of γ-PGA efficiently reduces osteoclast formation and bone destruction in animal model of rheumatoid arthritis (collagen-induced arthritis [CIA] in DBA/1J mice). Results: Firstly, we showed that γ-PGA strongly inhibits osteoclast differentiation in normal PBMC-derived osteoclast precursors and RA synovial fluid macrophages. γ-PGA suppressed RANK mRNA and protein level by down-regulating of M-CSF receptor protein, which is required for RANK expression. Furthermore, we found that in vitro, treatment with γ-PGA suppressed osteoclastogenesis in wild-type (WT) mice, but the inhibition mechanism of γ-PGA was not TLR4-dependent since γ-PGA still inhibited osteoclast formation in TLR4-deficient mouse BMMs. Reflecting on these in vitro effects, oral administration of γ-PGA markedly reduced bone destruction in CIA mice. Histological analysis confirmed that γ-PGA prevented bone destruction and osteoclast formation in the bone tissues. In addition, treatment with γ-PGA also suppressed the expressions of IL-1β and TNF-α. Conclusion: Our results show that γ-PGA markedly suppresses osteoclastogenesis in human and mice. γ-PGA also reduces bone destruction, osteoclast formation, and inflammatory cytokines in animal model of RA. Thus, these data suggest that γ-PGA can be a good candidate for the therapeutic application of joint destruction in RA.