질편모충으로 자극시킨 전립선상피세포의 염증반응에 의한 전립선암의 진행 기전

Abstract

질편모충 (Trichomonas vaginalis)은 성병을 일으키는 기생원충으로 전립선염, 양성전립선비대증 및 전립선암 환자의 소변이나 조직에서 발견되었다. 남성에 질편모충 감염은 무증상을 보이면서 장기간 잠복할 것으로 예상되어 왔다. 만성전립선염을 일으키는 질편모충은 IL-6와 연관된 발암성 factor의 발현을 통해 전립선암을 일으킬 수 있다고 제안되었으나 이에 대한 근거는 부족하다. 전립선상피세포에 질편모충을 자극 시 생산되는 IL-6, PGE2와 같은 염증성매개물질들은 종양미세환경 (tumor microenvironment)의 조성에 있어 중요한 역할을 하는 M2 대식세포로의 극성화 (polarization)에 영향을 준다고 알려져 있다. 전립선상피세포에 질편모충의 감염은 염증반응을 일으키며, 비만세포와의 crosstalk을 통해 전립선 기질세포의 증식을 일으킨다고 보고되었다. 그러나 질편모충의 전립선감염에 따른 염증반응이 전립선암의 진행을 일으키는지에 대해서 연구된 바가 없으며, 또한, 질편모충에 의한 전립선의 염증반응이 대식세포의 극성화를 통한 전립선 종양미세환경 조성에 미치는 영향에 대한 연구도 없다. 따라서 이번 연구에서는 질편모충 감염에 의한 전립선상피세포의 염증반응이 전립선암의 진행을 일으키는지 알아보고자 하였다. 1장에서는 질편모충에 의한 전립선상피세포의 IL-6 생산과 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 유도를 알아보았고, 2장에서는 질편모충으로 자극된 전립선상피세포의 염증반응이 전립선암의 증식과 침습에 영향을 주는지 확인하였으며, 3장에서는 질편모충감염에 따른 전립선상피세포에서 생산된 IL-6가 대식세포의 M2 분화 유도 및 M2 대식세포에 의한 전립선암의 진행을 확인하고자 하였다. 1) 질편모충에 의한 전립선상피세포의 염증반응과 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 유도: 전립선상피세포를 질편모충으로 자극하였을 때, 전립선암 증식에 있어 중요한 cytokine 중 하나인 IL-6가 생산되었고, ROS의 생산과 TLR2, TLR4, MAPK (p38, JNK, ERK), NF-κB 및 JAK2/STAT3의 발현을 확인하였다. IL-6 생산에 신호전달물질들이 관여하는지 알아보기 위해 TLR2, TLR4, MAPK (p38, JNK, ERK), NF-κB, JAK 및 ROS signal에 대한 항체와 억제제를 사용하였을 때, IL-6의 생산이 감소함으로써 IL-6 생산은 TLR2/4, MAPK (p38, JNK, ERK), NF-κB, JAK2/STAT3 및 ROS signal pathway를 통해 일어남을 알 수 있었다. 또한, 질편모충 감염 시 전립선상피세포의 세포독성과 상처회복, 조직재생과 연관된 Type II EMT의 유도가 일어나는 것을 확인함으로써 전립선상피세포의 조직손상에 따른 전립선기질세포로의 질편모충의 침습 가능성을 알 수 있었다. 2) 질편모충으로 자극된 전립선상피세포의 염증반응에 의한 전립선암세포의 진행 (증식 및 침습): 질편모충에 의한 전립선상피세포의 염증반응에서 암세포 증식에 영향을 준다고 알려진 염증매개물질들 (CCL2, IL-6, CXCL8와 PGE2 등)이 생산되었고, 이런 염증매개물질들이 포함된 전립선상피세포의 배양액으로 전립선암세포를 자극하였을 때, 전립선암세포의 증식과 침습성이 증가하였고, EMT의 유도가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 전립선암세포는 염증매개물질들에 대한 수용체 (CCR2, gp130, CXCR1/2와 EP2/4)의 발현이 증가하였고, 이들 수용체에 대한 항체들을 이용하여 수용체를 억제하였을 때, 전립선암세포의 증식과 이동이 감소됨을 확인하였다. 따라서 질편모충 감염에 따른 전립선상피세포의 염증반응은 cytokine-cytokine receptor signal pathway를 통해 전립선암세포의 진행을 유도함을 알 수 있었다. 3) 질편모충에 의한 전립선상피세포의 염증반응에 의한 M2 대식세포의 유도 및 대식세포와의 crosstalk을 통한 전립선암세포의 증식: 질편모충의 감염에 의한 전립선상피세포의 염증반응물질들 중 IL-6는 TAM (tumor-associated macrophage)으로 알려진 M2 대식세포로의 유도에 영향을 준다고 알려져 있다. 질편모충으로 자극한 전립선상피세포의 배양액을 대식세포에 반응시켰을 때, M2 대식세포의 marker인 IL-10, TGF-β의 생산과 CD36 mRNA의 발현을 증가시키며, 대식세포의 수도 증가하였다. IL-6 수용체에 대한 항체와 JAK 억제제를 처리하였을 때, M2 대식세포의 유도가 감소하였으므로 IL-6가 M2 유도에 관여함을 알 수 있었다. 또한, 질편모충으로 인한 전립선상피세포의 염증반응과 M2 대식세포와의 crosstalk을 통해 전립선암세포의 증식과 이동이 증가하고, 증식인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 질편모충에 의한 전립선의 염증반응은 M2 대식세포를 유도함으로써 전립선암의 진행을 일으키는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합하면, 전립선상피세포에 질편모충의 감염은 전립선상피세포의 TLR2/4-MAPK-NF-κB와 JAK signaling pathway를 통해 IL-6 생산을 증가시켰고, EMT를 유도하였다. 또한, 질편모충에 의한 전립선의 염증반응은 전립선암의 증식과 침습성을 증가시켰고, 대식세포의 이동 및 M2 대식세포로의 극성화를 일으킴으로써 전립선암의 증식을 증가시켰다. 따라서 질편모충 감염에 의한 전립선의 염증반응 (IL-6)은 전립선암의 진행을 일으키는 종양미세환경을 조성하는데 있어 중요한 인자가 될 수 있음을 알 수 있었다.; Trichomonas vaginalis as a protozoan parasite causing sexual transmitted disease was observed in human tissue of prostatitis, benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer (PCa). Over 75% of infected men with T. vaginalis are asymptomatic, and can remain undiagnosed and untreated, thus and this has been hypothesized to induce chronic prostatitis through chronic persistent prostatic infection. Also, T. vaginalis infection in prostate have been suggested that could induce tumorigenesis of prostate cancer through expression of oncogenes linked with IL-6 signaling, which play a critical role in chronic inflammation. However, the experimental study that inflammatory response by T. vaginalis infection in prostate induces the progression of prostate cancer has not been reported. In previous studies, we showed that T. vaginalis induces inflammatory response and migration of immune cells including monocytes and mast cells by producing proinflammatory cytokines such as IL-6, CCL2 and CXCL8 in prostate cells. Especially, IL-6 among these cytokines have been known to induce progression of prostate cancer as the mediator of chronic inflammation, and to influence om polarization of M2 macrophage that main component of tumor-associated macrophage, thus and to play a crucial role in tumor microenvironment to promote tumor growth, angiogenesis and metastasis. We have recently reported that T. vaginalis cause inflammatory response in prostate epithelial and stromal cells. However, no research has been conducted on whether the inflammatory reaction of prostate epithelial cells stimulated with T. vaginalis induces progression of prostate cancer. Therefore, inflammatory mediators produced by prostate epithelial cells with T. vaginalis infection could create tumor microenvironment. Thus, this study conducted aims as follows; i) signaling pathways associated with IL-6 production and epithelial-mesenchymal transition (EMT) induction in prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis, ii) progression of prostate cancer cells induced by inflammatory mediators of prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis, iii) IL-6 produced by prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis promotes proliferation of prostate cancer cells by inducing polarization of M2 macrophage. In chapter I, signaling pathways associated with IL-6 production and epithelial-mesenchymal transition induction in prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis: When prostate epithelial cells (RWPE-1) stimulated with T. vaginalis, production of IL-6 and ROS was increased, and Toll-like receptor (TLR) 2 and 4 as well as signal molecules such as MAPKs (p38, JNK, ERK), NF-κB and JAK2/STAT3 were also expressed. To determine whether signal molecules expressed by T. vagnalis stimulation involve in IL-6 production of prostate epithelial cells, we pretreated with antibodies and inhibitors against TLR2 and TLR4, MAPKs (each of p38, JNK and ERK), NF-κB, JAK and ROS signaling pathway. Consequently, up-regulated IL-6 production by T. vaginalis in prostate epithelial cells was significantly decreased by inhibiting TLR2/4, MAPKs, NF-κB, JAK and ROS signaling. Moreover, prostate epithelial cells stimulated with T. vaginalis resulted the reduction of cell viability and the EMT induction by decreasing the epithelial cell markers and increasing the mesenchymal cell markers. Taken together, it is suggested that T. vaginalis produce IL-6 via TLR2, TLR4, MAPKs, JAK/STAT3 and NF-κB, and induce EMT in prostate epithelial cells. In chapter II, progression of prostate cancer cells induced by inflammatory mediators of prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis: Prostate epithelial cells (RWPE-1) stimulated with T. vaginalis produced the inflammatory mediators such as IL-6, CCL2, CXCL8 and PGE2, and conditioned medium of prostate epithelial cells containing these inflammatory mediators produced by T. vaginalis stimulation (TCM) induced progression of prostate cancer cells (PC3, DU145 and LNCaP) including proliferation, migration, invasion and EMT. Also, prostate cancer cells treated with TCM expressed receptors such as IL-6R, CCR2, CXCR1/2 and EP2/4 for inflammatory mediators by prostate epithelial cells. In addition, prostate cancer cells pretreated with antibodies for gp130, CCR2, CXCR1/2 and antagonist for EP2/4 showed decreased proliferation and migration of prostate cancer cells. Therefore, inflammatory mediators such as IL-6, CCL2, CXCL8, and PGE2 released from prostate epithelial cells infected with T. vaginalis induced progression of prostate cancer via cytokine-cytokine receptor signaling pathway. In chapter III, IL-6 produced by prostate epithelial cells stimulated with Trichomonas vaginalis promotes proliferation of prostate cancer cells by inducing polarization of M2 macrophages : IL-6 known as proinflammatory cytokine has been reported to induce polarization of macrophage to M2-type macrophage. Prostate epithelial cells (RWPE-1) stimulated with T. vaginalis produced IL-6 and chemokines such as CCL2 and CXCL8, which attract immune cells including neutrophils and monocytes. When human macrophages were treated with conditioned medium of prostate epithelial cells co-cultured with T. vaginalis (TCM), it resulted polarization of M2-like macrophage by increasing the production of IL-10 and TGF-β, and the expression of CD36 and arginase-1 mRNA known as M2 macrophage markers. Moreover, proliferation of the M2-like macrophages was also increased by TCM. However, blockade of IL-6 receptor and JAK signaling in macrophages was inhibited differentiation of M2 macrophage polarization by TCM including IL-10 and TGF-β production and proliferation of macrophages. To determine progression of prostate cancer cells by crosstalk between macrophage and inflammation of prostate epithelial cells by T. vaginalis infection, prostate cancer cells (PC3, DU145 and LNCaP) were treated with conditioned medium of macrophages stimulated with TCM (M-TCM). Proliferation and migration of prostate cancer cells were significantly increased by M-TCM compare with that of TCM. Therefore, we suggest that IL-6 produced by prostate epithelial cells by T. vaginalis stimulation induce progression of prostate cancer cells through M2 macrophage polarization. In conclusion, we investigated whether inflammatory response of prostate epithelial cells infected with T. vaginalis could cause progression of prostate cancer by inducing tumor microenvironment. Taken all together, T. vaginalis infection in prostate epithelial cells increased the production of IL-6 through TLR2/4-MAPKs-NF-κB and JAK signaling pathway, and induced the EMT. IL-6, CCL2, CXCL8 and PGE2 produced by prostate epithelial cells stimulated with T. vaginalis induced the progression of prostate cancer cells such as proliferation and invasion via cytokine-cytokine receptor signaling pathway, and the polarization to M2-type macrophage. Furthermore, M2 macrophages differentiated by IL-6 produced by prostate epithelial cells with T. vaginalis enhanced proliferation and migration of prostate cancer cells. Thus, these results suggest that T. vaginalis may be one of factors to encourage tumor microenvironment that enhance progression of prostate cancer through induction of M2 macrophage polarization by causing the inflammatory response, especially IL-6, in prostate epithelium.