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크리스퍼 유전자 가위에 의한 비상동말단연결의 정확성 분석

Title
크리스퍼 유전자 가위에 의한 비상동말단연결의 정확성 분석
Other Titles
Evaluating the accuracy of non-homologous end joining induced by a CRISPR-Cas9 system
Author
양소연
Alternative Author(s)
Soyeon Yang
Advisor(s)
배상수
Issue Date
2017-08
Publisher
한양대학교
Degree
Master
Abstract
The CRISPR-Cas9 system enables targeted genome editing by inducing double strand breaks(DSBs) that are repaired by either of homology directed repair(HDR) or Non-homologous end joining(NHEJ). HDR can provide a precise genome modification in presence of a homologous template, whereas NHEJ leads to the junction formation containing non-specific nucleotide insertions and deletions(indels). The efficiency of HDR is considerably lower than that of NHEJ repair and HDR depends on phage of the cell cycle. For these reasons, NHEJ-mediated knock-in by CRISPR-Cas9 recently has been focused on diseases study and potential gene therapy. However, the accuracy of NHEJ repair induced by CRISPR-Cas9 system is still unknown. It has been challenging to evaluate the accuracy of NHEJ repair induced by a CRISPR-Cas9 because perfect joining of two ends causes re-cleavage by Cas9. To evaluate the accuracy of one time NHEJ repair, double stranded oligodeoxynucleotide(dsODN) was introduced at DSBs in HeLa and HEK293T cells. The accuracy values were evaluated at PAM distal and proximal sites of 18 different genes. This study showed that the accuracy of PAM distal site is higher than that of PAM proximal site in both cell lines. Also, the accuracy depended on specific sequences rather than positions on chromosome. These results enable to understand the mechanism of NHEJ repair induced by CRISPR-Cas9. Furthermore, this work provides for a strategy of novel and efficient gene modification.
3세대 유전자 가위인 크리스퍼 유전자 가위는 유전체 내에 특정 염기 서열을 인식하여 이중나선절단(double strand break, DSB)을 유도할 수 있다. 이중나선절단은 세포 내에서 상동재조합 (homology directed repair, HDR)이나 비상동말단연결(non-homologous end joining)에 의해서 수선된다. 상동재조합은 상동 염기 서열의 주형 DNA가 존재하는 경우, 상동성 주형 DNA를 바탕으로 수선하기 때문에 비교적 정확하게 수선이 일어난다. 반면에 비상동말단연결은 절단된 끝이 바로 연결되기 때문에 부정확한 수선이 일어나며, 유전체 내에 삽입과 결실을 일으킨다. 비상동말단연결은 상동재조합에 비해 높은 빈도로 일어나며, 세포주기에 영향을 받지 않는다. 이러한 이유로 최근 비상동말단연결을 이용한 유전자 치료제 개발 연구에 이용되고 있다. 그러나 크리스퍼 유전자 가위에 의해 유도되는 비상동말단연결이 얼마나 정확하게 이루어지는지를 정량적으로 분석이 어려워 알려지지 않았다. 이 연구에서는 비상동말단연결의 정확성을 측정하기 위해 크리스퍼 유전자 가위를 이용하여 DSB을 유도였고, 이중결합 올리고데옥시뉴클레오타이드를 녹인 시켰다. 비상동말단연결의 정확성은 PAM 서열에서 가까운 쪽과 먼 쪽에서 측정되었으며, 그 값은 타겟마다 다양하게 나타났다. 정확성은 PAM 서열에서 가까운 쪽보다는 먼 쪽에서 더 높게 측정되었으며, 염색체의 위치보다는 염기서열에 영향을 받는 특징을 보였다. 이러한 결과는 크리스퍼 유전자 가위에 의한 비상동말단연결이 일어날 때의 작동 원리를 규명하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 특정 염기 서열을 타겟하여 유전체 교정을 할 때 정교한 교정을 가능하게 하여 유전자 치료제에도 이용할 수 있을 것으로 전망된다.
URI
http://hdl.handle.net/20.500.11754/33735http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000431676
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GRADUATE SCHOOL[S](대학원) > THEATER & FILM(연극영화학과) > Theses (Ph.D.)
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