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Inhibition of biomarkers in asthma using RNA interference

Title
Inhibition of biomarkers in asthma using RNA interference
Author
최문환
Advisor(s)
임태연
Issue Date
2017-08
Publisher
한양대학교
Degree
Doctor
Abstract
Asthma is a multifactorial disease that is influenced by the interaction of genetic and environmental factors. Due to its complex nature, there is no cure for asthma currently. Instead, reliever and controller medications are used to treat asthma. Unfortunately, conventional treatments do not work in some severe cases of asthma. In addition, there may be adverse, systemic effects of long-term treatment with high-dose inhaled corticosteroids as a controller medication. Therefore, we attempted to develop a biomarker targeted therapy for asthma. Our regimen included dexamethasone as a controller medication and Gc siRNA as a novel target therapeutic. By using dexamethasone moiety of DEXA-PEI as an inhaled corticosteroids combined with anti Gc-protein treatment via delivery of Gc siRNA using DEXA-PEI as a siRNA carrier molecule. In mice asthma model, Ym1 and Ym2 are overexpressed in the airway. It suggests that knock-down of these proteins may be a therapeutic option for the disease. In this study, high mobility group box-1 A box (HMGB1A), a ligand to TLR4 and RAGE, was used as a carrier of Ym1 and Ym2 siRNA. The HMGB1A / siRNA complexes spontaneously formed due to the positive charges in HMGB1A. However, the HMGB1A / siRNA complex was not completely retarded in a gel retardation assay. To mask the negative charge of the complex, the R3V6 peptide was added, and forming a R3V6 / HMGB1A / siRNA triplex. The in vitro transfection assays showed that the triplex efficiently delivered Ym1 and Ym2 siRNAs to the cells and inhibited the expression of Ym1 and Ym2. Furthermore, administration of the R3V6 / HMGB1A / siRNA by intratracheal injection showed that the specific delivery to the alveolar macrophages and bronchial epithelium. Furthermore, triplex treatment of asthmatic mice effectively reduced Ym1 and Ym2 expression and suppressed the symptoms of asthma, such as airway inflammation and mucin secretion. Ezrin protein plays role of corss-links between the plasma membrane and the F-actin and regulate the function of cell migration, morphology and adhesion and cell signal processes. Ezrin protein is phosphorylated on their C-terminal threonine or serine residue is active in their cross-linking activity. Inhalation of the airborne particulate matters (PM) like titanium dioxide and silica dioxide can induce or aggravate the acute and chronic airway diseases. But, the underlying mechanisms of respiratory disease related pathophysiology remain poorly understood. Consequently, to explain this mechanisms, we investigated the connection between the effect of PM and the dephosphorylation of Ezrin using a proteomics approach. We have provided evidence that dephosphorylation of the Ezrin protein is concomitant with the PM treatment. This process may be associated with working of various phosphatases and kinases. Therefore, further studies should be need to research about the phosphatase and kinases inhibitor related signal pathway. In that case, the PRL3 inhibitor as regulation of phospho-Ezrin protein can provide a clue about respiratory diseases such as COPD, asthma.
천식은 유전적 요인과 환경적 요인의 상호 작용에 영향을 받는 여러 요인이 원인이 되는 질병이다. 복잡한 본성으로 인해 현재 근본적인 천식 치료법은 없다. 대신에 천식 치료 목적으로서 완화제와 항염증제가 사용된다. 불행히도 기존의 치료법은 일부 중증 천식 환자에서는 효과가 없다. 또한, 컨트롤러 약물로서의 고용량의 흡입용 코르티코스테로이드를 장기간 투여 할 경우, 부작용 및 역효과가 있을 수 있다. 따라서, 이 연구에서는 천식에 대한 새로운 병용 요법을 개발하려고 시도했다. 천식 치료제로 개발하기 위하여, 컨트롤러 치료제로서 덱사메타손 (dexamethasone)과, 새로운 타겟 치료제로 Gc siRNA를 이용하여 polymer를 형성하였다. 흡입용 코르티코스테로이드인 덱사메타손 약효 부분을 유지하고 Gc siRNA의 결합을 위해 폴리에틸렌이민 (PEI)를 링커로 사용하여, Gc siRNA 전달을 통해 Gc 단백질 치료와 흡입 코르티코 스테로이드를 병용 사용하여 시너지 효과를 얻고자 하였다. 또한, 천식 마우스 모델에서 Gc gene과 마찬가지로 Ym1 및 Ym2은 폐기도에서 과발현이 된다. 이러한 사실은 이들 단백질의 발현 억제가 질병에 대한 치료적 선택일 수 있음을 시사한다. 이를 위해 본 연구에서는 Ym1과 Ym2 siRNA의 운반체로 TLR4와 RAGE에 대한 리간드인 HMGB1A box (high mobility group box-1 A)를 사용하였다. HMGB1A / siRNA 복합체는 HMGB1A에서 양전하로 인해 자발적으로 형성된다. 그러나, HMGB1A / siRNA 복합체는 gel retardation 분석에서 완전히 분해되지 않았다. 복합체의 음전하를 상쇄하기 위해 R3V6 펩티드를 첨가하고 R3V6 / HMGB1A / siRNA 삼중체를 형성하였다. in virto의 형질 전환 분석은 R3V6 / HMGB1A / siRNA 삼중체가 Ym1 및 Ym2 siRNA를 세포에 효율적으로 전달하고 Ym1 및 Ym2의 mRNA 발현을 억제함을 보여 주었다. 또한, intratracheal injection에 의한 R3V6 / HMGB1A / siRNA 삼중체의 투여는 폐포 대식 세포 및 기관지 상피로의 특이적 전달을 보였다. 천식 마우스 모델의 challenge 시 3회 약물 처리는 Ym1 및 Ym2 발현을 효과적으로 감소시키고, 기도 염증 및 점액 분비와 같은 천식 증상을 억제함을 확인하였다. 이어서, 근본적인 폐질환 관련 연구를 위하여, 원형질막과 F-actin 사이의 corss하고 세포 이동, 형태 및 부착 및 세포 신호 과정의 기능을 조절하는 Ezrin 단백질을 타겟으로 연구하였다. Ezrin 단백질은 Ezrin의 C-termial의 threonined에서 인산화되거나 serine 잔기에서 crosslinking activity가 활성화된다. TiO2과 SiO2와 같은 공기 중 particulate matter (PM)의 흡입은 급성 및 만성기도 질환을 유발하거나 악화시킬 수 있다. 그러나, 이 반응의 기본 메커니즘은 아직 연구가 진행되지 않고 있다. 따라서, 이 메커니즘을 설명하기 위해, 우리는 proteomics 접근법을 사용하여 PM의 효과로 인한 인산화된 Ezrin의 탈인산화 과정의 연관성 및 점액(mucus) 발현에 미치는 영향을 연구했다. 우리는 Ezrin 단백질의 탈인산화가 PM 처리에 의해 수반된다는 증거를 제시했다. 이 과정은 다양한 phosphatase와 kinases의 작용과 관련이 있을 수 있다. 따라서, signal pathway와 관련된 phosphatase와 kinases inhibitor의 대한 연구가 필요하다. 이 경우, Ezrin 단백질의 탈인산화 억제 부위가 PM으로 자극 된 폐 질환 환자의 진단 marker 역할을 할 수 있다.
URI
http://hdl.handle.net/20.500.11754/33395http://hanyang.dcollection.net/common/orgView/200000430982
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